【佳学基因检测】AhR 和癌症：从基因检测分析到靶向治疗

肿瘤基因检测与靶向用药导读

芳烃受体 (AhR) 是一种配体激活的转录因子，已被证明是维持身体重要功能所需的广谱生物活动的重要调节剂。AhR 在肿瘤发生中也起关键作用。它在癌症中的作用是复杂的，包括促肿瘤和抗肿瘤活性。它的表达和活性水平对每个肿瘤和患者都是特定的，增加了理解芳烃受体配体的激活或抑制作用的难度。妇科肿瘤基因检测在靶向药物选择中的重要性课题组使用基因组数据集探索了芳烃受体在肿瘤细胞系和患者中的作用，并讨论了芳烃受体在多大程度上可以被视为治疗靶点。

关键词： AhR转录因子，表达，癌症，靶向治疗

1.简介

芳烃受体 (AhR) 是一种配体激活的转录因子，具有多种关键的细胞功能 。它属于基本的 helix-loop-helix/Per-Arnt-Sim (bHLH/PAS) 家族，广泛分布于组织和物种间 。脊椎动物分支中受体的进化导致其能够与多种结构不同的配体结合。事实上，AhR 与内源性（FICZ、犬尿氨酸等）和外源性（TCDD、BaP 等）低分子量平面配体结合，可表现出组织特异性激动剂或拮抗剂活性。在没有配体的情况下，AhR 构成细胞溶质多蛋白复合物的一部分，由 c-Src 激酶、Hsp90 以及伴侣蛋白 p23 和 XAP2组成。配体与芳烃受体的结合诱导构象变化，导致蛋白质复合物的解离和芳烃受体的核转位。在细胞核中，AhR 与其伴侣蛋白芳烃受体核转运蛋白 (ARNT) 二聚化，并与靶基因调控区域中的外源性反应元件 (XRE) 结合，诱导其转录 。

自 90 年代初以来，AhR 已被定义为一种重要的环境传感器，它能够以细胞类型和特定环境的方式响应广谱的配体激活或抑制细胞通路 。最近，它在癌症发展中的作用已得到证实，其中它可以作为致癌作用的正调节剂或负调节剂。

在这里，妇科肿瘤基因检测在靶向药物选择中的重要性课题组根据之前的研究和对一组遗传和基因组数据库的分析，总结了芳烃受体在癌症机制中的作用。然后，妇科肿瘤基因检测在靶向药物选择中的重要性课题组讨论将芳烃受体视为治疗靶点所需的条件。

2. 结果

2.1. 癌症中的芳烃受体突变、表达水平和激活

只有一种体细胞点突变在膀胱癌中具有高频率。这种位于 PAS-B 结构域（配体结合结构域）下游的突变（Q383H）尚未在功能上进行表征（图1A，底部）。尽管癌症中没有复发性遗传异常，但相对于健康组织，几乎 70% 的各种肿瘤类型中的AhR mRNA 水平升高(图1B)。事实上，AhR mRNA 在乳腺癌 、肺癌 、甲状腺癌  和口腔鳞状细胞癌 (OSCC)  中过度表达。在胰腺癌 、子宫内膜癌  和脑膜瘤  中也报告了高水平的芳烃受体蛋白。AhR的中位表达似乎从 I 期开始升高，与肿瘤类型无关，这表明这种增加的表达是许多癌症的早期事件(图1C）。因此，AhR表达与胶质瘤预后不良有关 。相反，原发性外周血慢性髓性白血病 (CML) 细胞中的AhR表达明显低于健康对照组，这支持了芳烃受体细胞特异性功能的概念 。

图1:芳烃受体 (AhR) 转录因子在癌症中的状态。( A ) 在来自癌症基因组学的 cBioPortal ( http://www.cbioportal ) 的患者或癌细胞系的所有遗传和基因组数据中分析了芳烃受体转录因子的改变频率（顶部）和突变状态（底部） 。组织）。AhR基因改变包括突变、扩增和深度缺失。( B )使用 GEPIA 2 (Gene Expression Profiling Interactive Analysis, http://gepia2.cancer-pku.cn )分析来自 TCGA 的所有癌症与正常组织中的AhR表达。( C ) AhR分析根据 1B 中描述的肿瘤分期表达。

除了AhR mRNA和蛋白质的过表达外，已发现受体的活性在各种类型的癌症中显着升高。例如，已在乳头状甲状腺癌 (PTC) 、原发性乳腺癌  和皮肤鳞状细胞癌 中观察到芳烃受体的表达和活性均升高。此外，AhR 的核定位与高级别间变性脑膜瘤  或卵巢癌 患者的预后较差有关。在这种情况下，Kolluri 等人。广泛描述了各种芳烃受体配体在癌细胞表型控制和肿瘤发展中的作用 。总体而言，很难在芳烃受体配体与其在控制增殖、迁移和肿瘤细胞侵袭中的作用之间建立明确的关系。事实上，肿瘤进展的后果似乎完全不同，这取决于肿瘤类型、配体的功能（AhR 激动剂或拮抗剂）以及细胞和蛋白质环境。卞等人。表明ITE（2-（1'H-吲哚-3'-羰基）-噻唑-4-羧酸甲酯）是一种内源性AhR配体，可抑制子宫内膜癌细胞的增殖和迁移。金等人。表明奥美拉唑和 2,3,7,8-四氯二苯并二恶英 (TCDD) 均能抑制乳腺癌细胞的侵袭，但只有奥美拉唑能抑制 Panc1 胰腺癌细胞的侵袭 。与此相反，一些研究表明，内源性或外源性配体激活芳烃受体会导致乳腺癌 [ 28、29 ]和暴露于犬尿氨酸 和苯并 (a)的肺癌细胞系中肿瘤细胞迁移和侵袭性增加芘 (BaP) 。虽然很难描述芳烃受体表达对致癌作用的影响，但不同配体的激活和各种辅因子的作用对于确定芳烃受体如何影响肿瘤发展和表型非常重要。AhR 配体在控制其活性方面的作用很难解释，因为单一配体 (TCDD) 的激活会引起基因表达的物种特异性变化。事实上，尽管物种之间的芳烃受体保守性相对较高（人类、小鼠和大鼠之间高达 73%），但其功能在小鼠中存在显着差异，对其配体 (TCDD) 具有更高的亲和力 。总体而言，必须以组织和物种特异性的方式研究芳烃受体配体在致癌作用中的作用。

在识别其同源 XRE 结合基序后，AhR 参与了许多基因的转录控制 。该基序在整个基因组中具有高度代表性，并且在物种之间是保守的 。杨等。使用 ChIP-seq 分析在 TCDD 诱导之前和之后对人类乳腺癌细胞中的芳烃受体结合位点进行全基因组定位和分析，并确定了多达 4000 个芳烃受体结合区域 。除了芳烃受体直接靶基因外，预计共调节的芳烃受体基因也参与芳烃受体反应。在这种情况下，妇科肿瘤基因检测在靶向药物选择中的重要性课题组分析了表达与AhR显着相关的基因，无论是正相关还是负相关。图 2A。大量基因的表达与肿瘤类型的AhR mRNA 水平显着相关（ p < 0.001），特别是肺和脑中的肿瘤类型(图 2A。正如预期的那样，它们因癌症类型而异。重要的是，在患者肿瘤样本 (TCGA) 中也观察到在细胞系 (GDSC 数据库) 中鉴定的AhR相关特征(图 2B)。

图 2:鉴定各种癌症中的芳烃受体相关基因特征。( A ) 火山图显示GDSC 数据库（药物敏感性基因组学）中各种癌细胞系（肺、脑-CNS（中枢神经系统）、乳房、皮肤）中表达与AhR mRNA 水平（A ）显着相关的基因在癌症中）（https://discover.nci.nih.gov/cellminercdb）。( B )芳烃受体mRNA 水平与先前确定的基因之间的表达 ( Spearman )相关性与肺癌细胞系 ( A) 在来自 TCGA 的两个数据集中，肺鳞状细胞癌 (LUSC) 肿瘤患者 ( n = 486) 与正常组织 ( n = 50) ( http://gepia2.cancer-pku.cn )。

2.2.芳烃受体的矛盾作用：致癌基因还是肿瘤抑制因子？

如前所述（图1A)，癌症中没有复发性的芳烃受体改变。然而，它在致癌过程中的作用已被明确确定，许多研究描述了它在几种癌症中的促肿瘤或抗肿瘤功能 [ 10 , 26 , 39 ]。这表明，AhR 表达水平和特定配体对其活性的调节可能会驱动肿瘤发生或抑制肿瘤发展。迄今为止，尚不清楚位于肿瘤微环境中的AhR配体是否可以将AhR活性调节到影响肿瘤发展的程度。几年前，AhR 的促肿瘤和抗肿瘤作用得到了广泛的评价 [ 10 , 26 , 39]，妇科肿瘤基因检测在靶向药物选择中的重要性课题组将只关注最新数据，以解决在这种复杂性背景下的芳烃受体活动。

2.2.1。AhR 作为癌基因

AhR 通过直接调节癌细胞的侵袭特性发挥促肿瘤因子的作用。已显示AhR的转录抑制可诱导肿瘤抑制基因E-钙粘蛋白( CDH1 ) 的表达，从而降低乳腺癌细胞系的间充质特性。相应地，AhR表达被证明与侵入性转录组特征相关，并且芳烃受体抑制降低了斑马鱼中乳腺癌细胞的转移潜力 。

奥皮茨等人。确定犬尿氨酸 (Kyn) 是一种色氨酸分解代谢物，可以结合并激活芳烃受体。犬尿氨酸被证明是一种内源性癌代谢物，可诱导结肠  和肺癌细胞  中生长控制基因的表达。在甲状腺肿瘤样本中，AhR 靶基因CYP1A1和CYP1B1相对于相关的健康组织被上调 ，Kyn 刺激甲状腺癌细胞系再次促进了 EMT 程序的获得（减少 E-钙粘蛋白，增加 SLUG，ñ-钙粘蛋白和纤连蛋白水平）。这导致增加的细胞运动和细胞侵袭。已知三种酶可催化色氨酸分解为 Kyn，即色氨酸-2,3-双加氧酶 (TDO)、吲哚胺-2,3-双加氧酶-1 (IDO1) 和吲哚胺-2,3-双加氧酶-2 (IDO2) . IDO1比IDO2更广泛地表达并且具有显着更高的酶活性率，而TDO具有与IDO不同的分布。在胶质瘤中，IDO1/TDO 被证明通过水通道蛋白 4 (AQP4)  的表达来解释 Kyn 释放和随后的芳烃受体激活介导的细胞运动。

除了依赖于 Kyn 的途径外，皮肤色氨酸光产物 FICZ (6-formyllindolo [3,2-b]carbazole) 对芳烃受体的激活可促进 TNFα 依赖性炎症并诱导黑色素瘤细胞分化和转移的发展。BaP 对芳烃受体的激活也被证明通过调节非小细胞肺癌 (NSCLC) 中的长链非编码 RNA 来影响 EMT 。同样，AhR 可以通过调节 TGF-β 信号传导重新激活乳腺癌中因 DNA 甲基化而沉默的 LINE-1 逆转录转座子，从而促进肿瘤发生和疾病进展 。

除了上述 IDO/TDO-Kyn-AhR 通路在癌症发展中的作用外，许多研究表明，AhR 的犬尿氨酸激活可诱导免疫抑制作用，产生免疫耐受树突状细胞 (DC) 和调节性 T细胞。在 DC 中诱导IDO表达也需要芳烃受体。总的来说，这促进了肿瘤微环境的获得，该微环境在识别和根除癌细胞方面存在缺陷。

总体而言，这一非详尽的研究集合表明，AhR 激活促进了各种癌症的肿瘤进展，并且犬尿氨酸激活的芳烃受体的免疫抑制特性构成了癌症治疗的一个非常有希望的轴 。

2.2.2. AhR 作为肿瘤抑制剂

尽管其作为癌基因的作用，AhR 在与脑和中枢神经系统、肝脏、消化系统、皮肤（黑色素瘤）和生殖道相关的许多癌症中充当肿瘤抑制因子。使用消除了芳烃受体表达的工程化小鼠模型（AhR -/-小鼠）发现了这种抑制作用。在该模型中，肝脏肿瘤的形成和生长显着高于对照小鼠，AhR -/-肝细胞显示出显着更高数量的 4N 细胞、增殖标志物的表达增加以及肿瘤抑制基因的抑制。因此，该模型中的AhR沉默与癌症进展有关 。

在结肠癌的背景下也获得了类似的结果。通过使用肠道特异性AhR -/-小鼠模型，Garcia-Villatoro 等人。证明在肠上皮细胞中表达AhR是减少癌前结肠癌病变形成所必需的。此外，高脂肪饮食加上肠上皮细胞中芳烃受体的丢失影响了结直肠癌的发展 。Shiizaki 等人。表明AhR激活诱导β-连环蛋白泛素化和随后的蛋白体降解。因此，由于异常的 β-连环蛋白积累，AhR -/-小鼠自发地发展出盲肠肿瘤 。同样，用 TCDD (0.1–100 nM) 治疗可减少人结肠直肠癌细胞的集落形成和增殖 。

据报道，犬尿氨酸激活芳烃受体可抑制肿瘤细胞的生长，促进细胞分化，并通过激活肿瘤抑制基因KISS1  减少小鼠肝和肺转移瘤的形成。

AhR 也被提出在黑色素瘤中具有肿瘤抑制功能，因为它的敲低促进了小鼠原发性黑色素瘤的肿瘤发生和肺转移。在这种情况下，AhR 可能会拮抗 Aldh1a1 的促肿瘤作用。因此，AhR低/Aldh1a1高表型可能表明黑色素瘤的预后不佳 。

萨里奇等人。通过控制 TGFβ/SMAD3 信号轴抑制增殖和促进癌症增殖细胞 (CPC)（能够肿瘤再生和治疗后复发的细胞库）的分化，将芳烃受体鉴定为 SHH 髓母细胞瘤小鼠模型中的有效肿瘤抑制因子。

在胶质母细胞瘤中，AhR 的抑制与 CXCL12-CXCR4-MMP9 信号通路的激活有关，参与细胞生长、侵袭迁移和细胞增殖 。在儿童神经母细胞瘤中，AhR 起着保护作用，因为它的表达与更好的结果相关。垂体腺瘤 (PA) 细胞中芳烃受体的过度表达揭示了潜在的肿瘤抑制活性，与 BaP 的外源性配体激活无关 。

最后，AhR 已被证明可以通过调节乳腺癌 、前列腺癌  和子宫内膜恶性肿瘤  中的几种肿瘤抑制 miRNA (microRNA) 来预防肿瘤发展。

总体而言，这些研究强调了芳烃受体作为肿瘤抑制因子的作用。然而，应该注意的是，这种肿瘤抑制功能主要在小鼠中描述，强调了物种间芳烃受体功能的特异性。

2.3. 在肿瘤疾病中靶向芳烃受体的治疗机会

如上所述，AhR 在癌症发展中的作用是复杂的（癌基因或肿瘤抑制基因）。尽管如此，它构成了一个有前途的药物靶点。靶向芳烃受体必须是患者和肿瘤特异性的，并且依赖于芳烃受体的表达和激活。需要解决三个主要问题以有效调节芳烃受体活性以治疗肿瘤疾病。他们是：

(a) 鉴定芳烃受体配体的激动剂或拮抗剂功能。此类配体可以在膳食分子（类黄酮）或 FDA 批准的药物中找到。

(b) 防止致癌芳烃受体激活剂的产生（内源性）或摄入（外源性）。

(c) 使用拮抗剂防止致癌配体和芳烃受体之间的相互作用。

也可以考虑替代的芳烃受体靶向策略，例如将芳烃受体作为补充目标以提高癌症治疗的效率或抵消耐药机制的手段。

2.3.1。AhR 作为直接药物靶点

在将芳烃受体作为癌症一线治疗的背景下，已经研究了许多策略。当肿瘤具有致癌功能时，已经测试了各种拮抗剂以降低肿瘤中的AhR表达水平。相反，其他研究旨在通过在转录因子作为肿瘤抑制因子时使用激动剂来促进芳烃受体的激活。

2.3.2. 通过芳烃受体激活限制肿瘤进展

使用有效的芳烃受体激动剂可以增强芳烃受体的活性，但相关的毒性可能是一个重要的缺点。事实上，TCDD 是一种剧毒的芳烃受体激动剂，尽管它通过破坏 CXCR4/CXCL12 通路  或卵巢癌细胞 对乳腺癌有积极作用，但它不能用于临床特异性靶向芳烃受体。因此，大多数研究调查了内源性或外源性分子抑制肿瘤进展的能力。

在最有希望的分子中，ITE 是一种内源性芳烃受体激动剂，通过下调 JAG1-NOTCH1 信号传导来降低三阴性乳腺癌 (TNBC) 的侵袭性 。ITE 在体外抑制子宫内膜癌 (EC) 细胞的增殖和迁移以及 EC 异种移植物在小鼠体内的生长 。它还抑制卵巢癌细胞的增殖和迁移。FICZ 还被证明对 LNCaP 细胞具有抗增殖和抗迁移特性，LNCaP 细胞是一种源自雄激素敏感的人前列腺腺癌细胞的细胞系 。最后，FICZ 显着降低了慢性粒细胞白血病 (CML) 中 CD34 阳性细胞的克隆形成潜力。

外源性芳烃受体激活剂 5F 203 (2-(4-amino-3-methylphenyl)-5-fluorobenzothiazole) 已在几种癌症中显示出积极作用。5F 203 诱导TNBC中推定的肿瘤抑制基因细胞红蛋白 ( CYGB ) 的表达 。它可减少胃癌 、人肾癌细胞  和卵巢癌细胞  的体外和体内细胞增殖。1998 年批准用于治疗类风湿性关节炎的抗炎药来氟米特已被证明是一种芳烃受体激动剂 。这种分子在癌症治疗中显示出前景，尤其是黑色素瘤 、膀胱癌 ] 和口腔鳞状细胞癌 。Indirubins E804 (indirubin-3'-(2,3 dihydroxypropyl)-oximether) 和 7BIO (7-Bromoindirubin-3'-oxime) 是天然靛玉红的合成衍生物，可激活芳烃受体并抑制重要的促炎细胞因子的合成，例如如 IL-6 和癌基因 STAT3。因此，它们可以构成有希望的胶质母细胞瘤新疗法 。

2.3.3。通过抑制芳烃受体限制肿瘤进展

当芳烃受体具有致癌活性或过表达时，最明显的策略是使用拮抗剂。已经使用化合物 3',4'-二甲氧基黄酮 (3',4'-DMF) 对乳腺癌细胞实现了芳烃受体的药理抑制，从而阻断了核芳烃受体复合物的形成 。相比之下，特异性拮抗剂 CH-223191 通过控制 TGFβ 通路来降低胶质瘤细胞的克隆形成存活率和侵袭性 。自从发现芳烃受体抑制的益处以来，许多研究旨在开发新的芳烃受体拮抗剂，例如使用原始体内（斑马鱼）模型  和计算机筛选 。在已鉴定的化合物中，CB7993113  和 GNF351  显示出有希望的抗癌活性。然而，在进入临床试验之前，它们佳学基因检测正在进行进一步评估。

天然物质，如膳食类黄酮、多酚，主要存在于水果、蔬菜和其他植物来源中 [ 84、85 ] ，它们通过控制AhR活性在抑制肿瘤发展中的有益作用已被大量研究[ 86、87、88 ]。类黄酮可诱导细胞凋亡和细胞周期停滞、代谢酶（特别是细胞色素 P450）的抑制、活性氧 (ROS) 的形成以及血管生成的促进 。已经对结肠直肠 、乳腺  和前列腺  进行了几项使用类黄酮治疗癌症的 II 期临床试验] 癌症和黑色素瘤 。然而，由于固有的限制，它们的临床应用受到限制，包括它们的分离/纯化和药代动力学挑战（例如，生物利用度、药物-药物相互作用和代谢不稳定性）。

尿石素 (UroA) 是天然多酚鞣花酸的肠道微生物群衍生代谢物，已被证明可拮抗芳烃受体 并诱导人类结肠癌细胞  和前列腺癌  衰老。最后，用于治疗癌症以外目的的各种药物显示出AhR拮抗剂活性。因此，这些 FDA 批准的分子可以重新用于癌症治疗。例如，抗麻风药物氯法齐明已显示出对多发性骨髓瘤患者的临床益处 。

可以通过靶向 HSP90/p23/XAP2/AhR 胞质复合物来破坏芳烃受体活性。HSP90 抑制剂（XL888 或 ganetespib）诱导其客户蛋白（包括 AhR）的降解。增加剂量的 HSP90 抑制剂与 BRAF 抑制剂 (vemurafenib) 联合使用可提高 BRAF V600E 突变黑色素瘤患者的总体存活率 。由于 HSP90 抑制剂显示出非常广谱的作用 ，因此可以通过靶向辅助伴侣蛋白 p23 来优化芳烃受体的降解。p23 蛋白的下调会触发芳烃受体 的泛素化，并且 p23（苦艾酮）的特异性抑制在体外显示出重要的抗癌作用 。

最后，IDO 抑制剂在癌症治疗中的可能用途受到了广泛关注 。尽管此类治疗不直接针对 AhR，但它们可能会减少犬尿氨酸的产生，从而降低对免疫检查点抑制剂的抵抗力 。

迄今为止，仅启动了两项 1 期临床试验来测试癌症中芳烃受体的直接调节。第一项是由拜耳 (Leverkusen, Germany) 进行的非随机临床试验，旨在评估芳烃受体抑制剂BAY2416964对 114 名晚期实体瘤患者（肺癌、头部和颈癌和结直肠癌）（NCT04069026）。Ikena Oncology ®（前身为 Kyn Therapeutics ®）（波士顿，马萨诸塞州 02210，美国）也于 2019 年 12 月开始了 1 期非随机、开放标签、临床试验，以确定 KYN-175（一种芳烃受体抑制剂）的耐受性和毒性， 53例晚期实体瘤患者（NCT04200963）。这两项临床试验的首批结果预计将在 2022 年底取得。这些试验强调了将芳烃受体视为下一代癌症治疗的重要性。同样值得考虑将芳烃受体作为一种补充疗法，与目前使用的疗法（即靶向疗法和免疫疗法）相结合。

2.3.4。改进芳烃受体靶向治疗的芳烃受体相关基因特征

由于AhR在癌症中的作用很复杂，妇科肿瘤基因检测在靶向药物选择中的重要性课题组建议通过考虑AhR表达水平（高/低）来定制AhR治疗策略（（图1B) 及其特定于肿瘤类型的相关基因特征 (图 2A) 和患者 (图 3A。例如，AhR 高特征与不良预后相关，而芳烃受体低相关特征与肺鳞状细胞癌 (LUSC) 的良好预后相关(图 3A，B)。正如预期的那样，肺特异性芳烃受体相关特征在其他肿瘤患者的生存方面没有区别，例如皮肤皮肤黑色素瘤 (SKCM)(图 3C），或可转座到所有肿瘤（图 3D)。因此，可以根据芳烃受体特异性相关基因特征和患者结果选择拮抗或激活 AhR。

图 3:LUSC中的AhR相关基因特征。( A ) 表达热图显示鳞状细胞肺癌患者中几个芳烃受体相关基因的表达 ( n = 486)。在整个群组中具有相似表达谱的基因和簇在网格中彼此靠近放置。( B - D ) LUSC 癌症患者 ( B )、皮肤黑色素瘤 (SKCM) 患者 ( C ) 和来自 TCGA ( D ) 的所有癌症患者的无病生存曲线，取决于与先前确定的基因相对应的芳烃受体特征作为肺癌细胞系中最正和负相关（n = 48）。

2.3.5。AhR 作为选择最有效靶向治疗的预后标志物

另一种可能的策略是考虑将AhR表达水平及其活性（相关基因的表达）作为新推定癌症疗法的替代标记。

妇科肿瘤基因检测在靶向药物选择中的重要性课题组通过建立来自GDSC数据库（癌症药物敏感性基因组学，图 4A。妇科肿瘤基因检测在靶向药物选择中的重要性课题组观察到药物效率 (IC50) 和AhR mRNA 水平之间存在显着相关性 ( p < 0.001)。这种相关性对每种肿瘤都是特定的，在肺癌细胞系中相关性最高（图 4A。这种相关性分析使得在已经可用的分子中识别出那些根据AhR水平适应肿瘤类型的分子成为可能。例如，靶向凋亡抑制剂 Bcl-2  的 ABT-263 (Navitoclax) 在弱表达AhR的肺癌细胞系中更有效（左图图 4A。MEK 抑制剂曲美替尼对强烈表达AhR的肺癌细胞更有效（右图）图 4A。重要的是，与芳烃受体调节因子 ( AhRR )的表达没有相关性(图 4B）。

图 4:用于识别各种癌细胞系中治疗策略的芳烃受体特征。( A ) 火山图显示来自 GDSC 数据库（癌症药物敏感性基因组学， https://discover.nci）的各种癌细胞系（肺、脑-CNS、乳腺、皮肤）中药物效率 (IC50) 的相关性。 nih.gov/cellminercdb）具有标准化水平的AhR mRNA（RNAseq 数据）。当AhR水平低时最有效的药物显示在左侧，而当AhR水平高时最有效的药物显示在右侧。（乙) 火山图显示来自 GDSC 数据库（癌症药物敏感性基因组学， https://discover.nci.nih）的各种癌细胞系（肺、脑-CNS、乳腺、皮肤）中药物效率 (IC50) 的相关性。 gov/cellminercdb ) 与芳烃受体调节因子 ( AhRR) mRNA 的水平。（C，D）表达热图显示肺癌细胞系（C）和皮肤黑色素瘤细胞系（D）中与AhR最相关（正或负）的基因的表达，就选择的治疗而言效率与AhR水平相关表达。在整个群组中具有相似表达谱的基因和簇在网格中彼此靠近放置。

除了AhR表达水平之外，还可以考虑芳烃受体相关特征来评估治疗的潜在有效性。事实上，妇科肿瘤基因检测在靶向药物选择中的重要性课题组发现这些基因特征与之前在图 4A 在肺癌细胞系 (LUSC) (图 4C）。用黑色素瘤细胞系获得了可比的结果（图 4D)。妇科肿瘤基因检测在靶向药物选择中的重要性课题组进行了额外的体外研究，以验证与芳烃受体水平密切相关的抑制剂的有效性（图 4）。因此，妇科肿瘤基因检测在靶向药物选择中的重要性课题组在存在或不存在芳烃受体转录因子（CRISPR-Cas9 沉默）的情况下，在黑色素瘤系 SKMel28 上测试了 ABT-263、SB505124、阿法替尼和 CHIR-99021_1241（图 5A）。简而言之，SKMel28 和 SKMel28芳烃受体KO 细胞以导致细胞活力 (IC50) 降低约 50% 的剂量处理 48 小时。ABT-263 (5 μM) 和 SB505124 (20 μM) 在没有芳烃受体(SKMel28芳烃受体KO) 的情况下更有效 (图 5B）。相反，Afatinib (20 μM) 和 CHIR-99021 (20 μM) 在存在芳烃受体(SKMel28) 的情况下更有效（图 5B)。这些结果与在图 4显示不同肿瘤细胞系对不同治疗的敏感性之间的相关性作为AhR和AhR相关基因表达水平的函数。因此，他们增强了分析AhR表达水平和相关转录特征以定义特定抗肿瘤策略的兴趣。

图 5:在存在或不存在芳烃受体的情况下，SKMel28 黑色素瘤细胞系的药物效率。（一）在存在或不存在 AhR（CRISPR/Cas9）的情况下，通过蛋白质印迹在 SKMel28 细胞中分析相对于 HSC70 的芳烃受体蛋白水平。( B ) SKMel28 和 SKMel28芳烃受体KO 细胞以导致细胞活力 (IC50) 降低约 50% 的剂量处理 48 小时。直方图显示用 ABT-263 (5 μM)、SB505124 (20 μM)、Afatinib (20 μM) 和 CHIR-99021_1241 (20 μM) 处理后的细胞活力百分比 ( n = 3)。每个直方图代表平均值±标准差；使用Sidak-Bonferroni 方法（n = 4-6）进行非配对t检验。

2.3.6。AhR 作为癌症治疗的致敏剂

迄今为止，AhR 作为现有靶向癌症治疗的致敏剂的作用很少被研究。在这种情况下，除了 FDA 批准的靶向治疗外，还可以考虑分别使用激动剂或拮抗剂促进或抑制芳烃受体信号通路。妇科肿瘤基因检测在靶向药物选择中的重要性课题组已经报道了使用 BRAF V600E/K 抑制剂 (BRAFi) 治疗转移性黑色素瘤的这种策略。妇科肿瘤基因检测在靶向药物选择中的重要性课题组表明，获得 BRAFi 耐药性伴随着细胞系和患者中芳烃受体特征的强烈诱导。AhR 拮抗剂，如白藜芦醇，可增加 BRAFi 敏感性并延迟 PDX 黑色素瘤的复发 。同样，山下等人。证明AhR通过药物的广泛代谢增强TNBC中的AKR1C3表达来抵消多柔比星（DOX）的功效。DOX 的细胞毒作用在芳烃受体-/- MDA-MB 231 TNBC 细胞中更为明显 。

基底样和 BRCA1 相关乳腺癌的遗传和代谢改变可导致慢性高水平 ROS，增加芳烃受体蛋白水平及其转录活性。在这些条件下，AhR-AREG（双调蛋白）信号通路通过控制 ROS 和塑造肿瘤微环境的促肿瘤发生功能，积极支持肿瘤发生。鉴于芳烃受体抑制对 AREG 水平和 EGFR 磷酸化的影响，已经探索了芳烃受体抑制与 EGFR 抑制剂（厄洛替尼）的协同作用，并显示出有希望的组合抗肿瘤作用 。

2012 年，Barretina 等人。创建了“癌细胞系百科全书”，将 947 种人类癌细胞系的表达数据以及它们各自对 24 种抗肿瘤疗法的敏感性进行分组 。他们发现，AhR表达与 MEK 抑制剂在NRAS突变黑色素瘤细胞系中的功效有关。AhR的沉默抑制了NRAS的生长- 表达高水平AhR的突变黑色素瘤细胞。这一发现强调了它们对芳烃受体功能的生长依赖性。该研究还强调了几种 MEK 抑制剂作为芳烃受体拮抗剂的潜在作用。总体而言，这些结果表明 MAPKinase 激活可能与芳烃受体依赖性同时发生，并且升高的芳烃受体水平可能作为NRAS突变黑色素瘤背景下对 MEK 抑制剂敏感性的生物标志物。

在癌症免疫治疗和 IDO/TDO/Kyn 通路的背景下，AhR 在调节治疗反应中的作用得到了更广泛的研究，将芳烃受体与免疫反应联系起来 。IFN-γ 通过 IDO/TDO/Kyn 依赖性途径诱导肿瘤再生细胞 (TRC) 进入休眠状态并逃避免疫监视  阻断 IDO/AhR 可消除 IFN-γ 诱导的休眠并通过抑制STAT3/p53 通路 。用酪氨酸激酶抑制剂 (TKis) (达沙替尼) 治疗也可以抵消 IDO 在肿瘤微环境中诱导耐受 DCs 的作用。TKis 可用于调节 DC 免疫原性活性，并可能作为芳烃受体或 IDO 抑制剂的补充用于基于 DC 的癌症免疫治疗 。

尽管针对癌症的芳烃受体临床试验仍然非常罕见，但针对 IDO/TDO/Kyn 通路的试验数量已达到 100 项。这些试验（1 期 4 项，2 期 8 项，3 期 9 项）正在使用 IDO 抑制剂（Epacadostat、Indoximolod、GDC-0919 等）联合免疫疗法（抗 PD-1：纳武利尤单抗或派姆单抗、抗 CTLA4：易普利姆玛等）或针对不同类型癌症（肺癌、乳腺癌、胰腺癌）的靶向化疗， ETC。）。设想直接针对芳烃受体和 IDO/TDO/Kyn 通路的补充治疗试验是合理的。

2.3.7. AhR 作为对抗靶向治疗耐药性的药物靶点

靶向治疗耐药机制的发展极大地限制了患者治疗癌症的结果。妇科肿瘤基因检测在靶向药物选择中的重要性课题组最近将芳烃受体转录因子与激活增加后获得这种抗性机制有关。妇科肿瘤基因检测在靶向药物选择中的重要性课题组发现，在转移性黑色素瘤的治疗中，AhR 的持续激活会诱导与 BRAF 抑制剂耐药相关的基因表达 。

同样，AhR 通过 Src 激酶介导 PI3K/Akt 和 MEK/ERK 信号传导的激活，并诱导 EGFR 突变的 NSCLC 细胞对 EGFR-Tki（吉非替尼）产生耐药性 。在此背景下，妇科肿瘤基因检测在靶向药物选择中的重要性课题组分析了对 EGFR TKi 敏感或耐药的各种肺癌细胞系（分别为 PC9 和 Hcc827）的表达数据(图 6A—Song 等人的数据），（图 6B——来自 Ware 等人的数据）。妇科肿瘤基因检测在靶向药物选择中的重要性课题组建立了与AhR表达正相关或负相关的基因的表达特征(图 2）。这种对敏感细胞和耐药细胞进行分类的相关芳烃受体特征可用作 TKI 耐药性的标志物(图 6A，B)。

图 6: 酪氨酸激酶抑制剂 (Tki) 耐药 (吉非替尼) 肺癌细胞系中的芳烃受体特征。（一，B)表达热图显示与AhR mRNA水平相关性最高（正或负）的基因的表达（图 2A) 在对来自 Song 等人的数据集的 Tki (吉非替尼) 敏感或耐药的肺癌细胞系中。 ( A ) 和 Ware 等人。（B)。在整个群组中具有相似表达谱的基因和簇在网格中彼此靠近放置。

此外，高剂量的芳烃受体配体氨基黄酮 (AF) 可作为芳烃受体拮抗剂，抑制 Src-Akt 信号传导并抑制 α6-整合素表达，从而减弱 MCF-7 乳腺癌细胞对他莫昔芬的耐药性 。

组蛋白去乙酰化酶抑制剂 (HDACis) (Aza-PBHA) 现在广泛用于抗癌治疗。然而，由于获得性耐药性和相对较低的特异性，它们在很大程度上对晚期癌症无效。Aza-PBHA 通过促进 HDAC 与芳烃受体的相互作用来增加人胃癌细胞中 PKCα 磷酸化和组蛋白乙酰化水平。因此，使用 PKCα 抑制剂来控制与芳烃受体相关的表观遗传调控是一种很有前途的潜在方法，可以预防对基于 HDACi 的癌症治疗的获得性耐药 。

也可以在耐药性的情况下控制芳烃受体蛋白水平。他等人。已经表明，针对共同伴侣蛋白 p23 的臭椿酮克服了去势抵抗性前列腺癌中的 MDV3100 耐药性 。

总体而言，这些研究表明，不仅要分析芳烃受体的水平及其活性，还要分析其相关基因特征和通路在增强靶向治疗耐药性的背景下。

总之，在识别遗传改变（体细胞突变、融合转录本、扩增、缺失等）方面的重大进展使得癌症治疗从全身化疗（DNA烷化剂、抗有丝分裂剂等）转变为靶向治疗成为可能。疗法（激酶抑制剂、免疫检查点抑制剂）（图 7）。通过使用单一疗法和组合疗法，这显着提高了患者的生存率。

图 7:精准医学和癌症的个性化治疗。

在这里，妇科肿瘤基因检测在靶向药物选择中的重要性课题组提出了几种在精准医学背景下治疗癌症的治疗策略，这些策略可以通过考虑芳烃受体转录因子的水平和活性来应用(图 7）。在最好的情况下，靶向治疗长期有效，患者肿瘤完全消退。然而，大多数患者表现出短期反应，随后出现耐药机制，限制了治疗益处。触发芳烃受体可能是一个有前途的选择。根据芳烃受体的表达和活性水平（AhR 特征），可以首先将芳烃受体视为使用芳烃受体激动剂或拮抗剂的直接药物靶点。在精准医疗环境中，AhR 也可以被视为一种预后标志物，用于识别在治疗过程中单独使用或与芳烃受体激动剂或拮抗剂联合使用的新推定治疗分子。最后，在与芳烃受体相关的抗性机制的背景下（AhR 签名的放松管制），可以考虑使用新的抑制剂（单独或与芳烃受体激动剂/拮抗剂联合使用）来提高治疗敏感性并预防或减缓耐药性的发展。总体而言，AhR 的触发用于癌症治疗显示出巨大的潜力。

3. 方法

3.1. 试剂

研究中使用的抑制剂如下：Navitoclax (ABT-263) (Selleckchem, Houston, TX 77054 USA, S1001)、Afatinib (BIBW2992) (Selleckchem, S1011)、SB505124 (Selleckchem, S8523) 和 CHIR-99021 ( Selleckchem，CT99021）。

3.2. 细胞培养和试剂

人黑色素瘤细胞系（SK28 和 501 Mel）在补充有 10% 胎牛血清（Eurobio， Les ULIS, France) 和 1% 青霉素-链霉素抗生素 (Gibco, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)。SK28 细胞从位于比利时鲁汶 VIB 的 VIB（Vlaams Instituut voor Biotechnologie）癌症生物学中心的 JC Marine 实验室获得。所有细胞系都进行了支原体污染的常规检测。

3.3. CRISPR/Cas9 实验

使用 CRISPR/Cas9 方法进行芳烃受体敲除。根据制造商的说明 (Life Technologies, Saint-Aubin, France)，将靶向芳烃受体(Sigma-Genosys, St. Louis, MO, USA) 的指导序列克隆到 GeneArt CRISPR 核酸酶载体中。接下来，将载体转染到 SK28 细胞中，两天后将细胞以 0.5 个细胞/孔接种到 96 孔板中，用于单细胞克隆扩增。感兴趣的克隆通过 DNA 测序、蛋白质印迹分析和 RT-qPCR  进行了验证。

3.4. 细胞密度评估

使用亚甲蓝比色测定法评估细胞密度。简而言之，将细胞在 95% 乙醇中固定至少 30 分钟。去除乙醇后，将固定的细胞干燥并用硼酸盐缓冲液中的 1% 亚甲蓝染料染色 30 分钟。用自来水冲洗四次后，向每个孔中加入 100 μL 0.1 N HCl。接下来用分光光度计在 620 nm 处分析板。

3.5. 蛋白质印迹

蛋白质样品在 95 °C 下变性，通过 SDS-PAGE 分离，然后转移到 Hybond™-C Extra 硝酸纤维素膜（Amersham Biosciences，Bucks，UK）上。用适当的抗体探测膜，并使用 Fujifilm LAS-3000 Imager（Fuji Photo Film，Tokyo，Japan）检测信号。一抗是抗-AhR (A3) 和 Hsc70 (B6) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)。辣根过氧化物酶偶联二抗购自 Jackson ImmunoResearch (Suffolk, UK)，并以 1:10,000 的稀释度使用。

3.6. 数据挖掘

使用可公开访问的网络服务器 GEPIA2 ( 进行荟萃分析并进行可视化）。GEPIA2 是 GEPIA 的更新版本，用于分析来自 TCGA 和 GTEx 项目的 9736 个肿瘤和 8587 个正常样本的 RNA 测序表达数据，使用标准处理管道。GEPIA2 提供可定制的功能，例如肿瘤/正常差异表达分析、根据癌症类型或病理阶段进行的分析、患者生存分析、相似基因检测、相关性分析和降维分析。该工具由北京大学张实验室的 Zefang Tang、Tianxiang Chen、Chenwei Li 和 Boxi Kang 开发 。正常组织和癌症之间的基因表达通过条形图或在阶段图中绘制的病理阶段可视化。总体或无病生存已在所有癌症数据集中可视化，具体取决于癌症的水平AhR表达式，通过基于 Cox PH 模型计算风险比。

使用用于癌症基因组学的开源工具 cBioPortal ( http://www.cbioportal.org ) 的生物信息学从可用数据库的集合中搜索转录因子芳烃受体的突变（突变、扩增、缺失等）用于各种类型的癌症（180 项患者和细胞系研究）（http://www.cbioportal.org/datasets）。有关用于调用突变的工具和可能已应用的过滤器的具体信息，请参阅已发表的手稿 。

对 GDSC（Sanger/Massachusetts General Hospital Genomics of Drug Sensitivity in Cancer）进行了 RNAseq 数据集的分析，并从 CellMinerCDB 网络工具（https://discover.nci.nih.gov/cellminercdb）中恢复。CellMinerCDB 是一个交互式 Web 应用程序，可简化跨不同来源的癌细胞系药物基因组数据的访问和探索。该网络工具允许比较跨组细胞系的分子和/或药物反应模式，以寻找可能的关联。AhR表达与报告的p值（未针对多重比较进行调整）之间的 Pearson 相关性（图 4A) 和所有其他基因的表达或AhRR表达 (图 4B) 恢复了不同癌细胞系（肺n = 209，脑n = 90，乳房n = 54，皮肤n = 67）的药物活性表达（297 种化合物）。

RNA seq 数据的原始数据计数矩阵是从 GEO 数据库中获得的，用于先前对肺癌细胞系（对 EGFR 抑制剂敏感或耐药：吉非替尼）GSE79688的实验[ https://www.ncbi.nlm。 nih.gov/gds/?term=GSE79688 ]  和GSE129221 [ https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/?term=GSE129221 ] 。

使用R/Bioconductor 中的 ComplexHeatmap 2.0.0  包，获得了样本之间差异表达基因的表达热图，用于 log2 倍的变化。通过将样本与其余样本进行对比来获得集群特异性基因排名。使用 GraphPad PRISM 8.0 建立与表达或药物敏感性相关的火山图。

缩写

AhR and Cancer: From Gene Profiling to Targeted Therapy.

Paris A, Tardif N, Galibert MD, Corre S.

Int J Mol Sci. 2021 Jan 13;22(2):752. doi: 10.3390/ijms22020752.