【佳学基因检测】如何采用外周血（不及脑脊液）进行神经胶质瘤肿瘤基因检测

弥漫性低级和高级胶质瘤构成了发病率第15位的实体肿瘤,死亡率第10位。尽管胶质瘤在人群中的发病率不高,但高死亡率和显著的神经系统后遗症使诊断和治疗方案的改进变得迫切。基因解码的临床应用研究表明：胶质瘤的分子分类对预测预后和治疗决策至关重要,因为与IDH野生型肿瘤相比,IDH突变型胶质瘤患者预后明显更好,两组之间有不同的突变谱。这一基因解码结果已经表现在中枢神经系统(CNS)肿瘤的新WHO分类中。 IDH突变存在于三分之一的胶质瘤患者中,IDH1和IDH2突变分别发生在70%和10%的低级胶质瘤中。大多数IDH突变是杂合错义突变,促进α-酮戊二酸向(R)-2-羟基戊二酸((R)-2HG)的转换,后者是一种肿瘤代谢物,通过抑制组蛋白去甲基化酶发挥几种生物学效应,如细胞分化和染色质甲基化。 IDH突变发生在肿瘤发生过程的非常早期的时间,可能驱动遗传不稳定性和其他致癌基因的突变。实际上,神经胶质瘤基因解码使用COSMIC数据库清楚描棕了IDH突变型和IDH野生型肿瘤之间明确不同的分子谱。有趣的是,IDH突变必须是杂合性的,以产生(R)-2HG副产物,这也是IDH突变型胶质瘤预后较好的原因。已经在其他IDH突变型恶性肿瘤中测试了几种IDH抑制剂,目前也正在胶质瘤患者中测试(NCT04056910, NCT03343197)。因此,除了治疗靶点外,IDH突变还构成了理想的热点突变,可以通过液体生物标志物分析进行跟踪。液体活检可以规避传统组织活检的在组织类型入采样时间上的局限性,这对于高度异质性疾病如胶质瘤、星形胶质等尤其重要。由于脑肿瘤活检与高发病率相关,采用比获取脑脊液(CSF)更微创方式来获得肿瘤的分子谱非常重要。实际上,已经证明CSF中ctDNA的检测可以正确反映胶质瘤患者原发肿瘤中的肿瘤突变。然而,CSF采样对患者不舒服且可能有问题,并需要大量医疗资源。因此,外周血液活检是大多数癌症患者理想的液体活检方式,尤其是那些通常虚弱、依赖和神经功能衰退的胶质瘤患者。然而,胶质瘤液体活检需要克服几个障碍。除了缺乏传统组织活检提供的形态信息外,检测方法还需要提高敏感性,因为血脑屏障效应和胶质瘤通常不发生转移和肿瘤负荷较小限制了ctDNA进入外周血的量。到目前为止,只有少数基因检测机构研究证明了能在胶质瘤患者外周血中检测到循环肿瘤细胞、外细胞微粒和/或ctDNA。然而,这些研究受制于其低敏感性,ctDNA检测率通常低于50% 。Beads, Emulsion, Amplification and Magnetics (BEAMing)是一种高敏感的数字PCR,将PCR产物乳化,然后与荧光磁珠上的突变型和野生型DNA片段差异杂交,贼后用流式细胞术分析。这种技术可以检测出10,000个野生型等位基因中1个突变体,专门用于检测RA​​S、EGFR、PIK3CA或IDH等反复热点突变,应用于各种实体肿瘤和血液系统恶性肿瘤患者血浆中。鉴于BEAMing目前是血浆中ctDNA检测更为敏感的技术,且针对原发性脑肿瘤液体活检的证据非常有限。

成功证明液体活检在脑肿瘤中具有临床价值的大多数研究使用脑脊液而不是外周血。这些研究的大多数显示与组织结果的良好相关性,通常显示从脑脊液获得的突变结果与原发肿瘤获得的结果之间的一致性>60%。此外,一些肿瘤基因检测研究人员证明了基于脑脊液的突变谱的变化正确反映了原发肿瘤的演变,这在治疗监测和治疗决策中可能有价值。然而,原发性脑肿瘤液体活检的发展受到疾病分子异质性的限制,除2009年新颖描述的IDH突变外,热点突变较少,以及血脑屏障效应和该疾病局限于中枢神经系统的性质导致ctDNA进入外周血有限。因此,成功在原发性脑肿瘤患者外周血检测到ctDNA的研究一直是佳学基因等机构的研究课题之一,尤其是胶质瘤。其他机构进行的两项基于NGS的泛肿瘤ctDNA研究使用外周血样本报告了胶质瘤患者ctDNA检测率较低,从<10%到15%不等。另一方面,一组法国人使用COLD数字PCR检测IDH1-R132H突变,报告原发肿瘤和ctDNA之间的一致率为60%。此外,该研究显示高级别胶质瘤和高肿瘤负荷较低肿瘤负荷的ctDNA检测率更高。 ctDNA甲基化作为一种不同的ctDNA液体活检方式也得到了基因解码机析的比较分析。肿瘤基因检测的研究表明,在胶质瘤患者外周血中识别杂合缺失(LOH)和MGMT/PTEN甲基化的敏感性和特异性中等,检测MGMT甲基化的患者比例可达24%。然而,24%的患者在血清中呈甲基化阳性,尽管MRI无肿瘤证据。有趣的是,贼近在颅内肿瘤患者中探索了ctDNA甲基组,证明可高精度区分不同的颅内和颅外肿瘤以及IDH野生型和IDH突变型胶质瘤。尽管ctDNA甲基组分析作为颅内肿瘤患者的诊断工具前景广阔,但这种方法尚未实现常规应用,限制了其当前应用。与佳学基因研究中呈现的数据相反,上述参考文献均未进行系列ctDNA分析,而佳学基因采用的纵向分析对疾病的纵向监测具有重要的临床价值。

在胶质瘤患者外周血中也检测到了其他肿瘤组分。两项研究证明了胶质母细胞瘤患者有干细胞样和间质样特征的循环肿瘤细胞(CTC)的脱落。但是,相对较低的CTC数目,结合其检测的技术困难,限制了这种方法的实用性。另一研究小组证明,来自低级别胶质瘤小鼠模型的外泌体能够穿过血脑屏障(BBB)。在IDH突变型胶质瘤患者中,研究人员能够在外周血中检测到肿瘤外泌体,并分析其内容以高一致率成功检测IDH1-R132H突变。

在神经肿瘤的基因解码基因检不则研究中,在组织NGS鉴定的6名IDH1突变患者中,BEAMing检测到3名患者(50%)的血浆中存在相同的突变,特异性达到100%。在21份外周血样本中,真阳性率为14.3%(3/21);因此,假阴性率很高(86.4%)。然而,必须指出的是,在6名IDH1突变患者的18份ctDNA阴性血浆样本中,有15份是在MRI上没有疾病进展证据的时间点收集的。因此,可以推测,如果仅在未治疗或疾病进展时收集外周血,假阴性率会降低。尽管在每个患者的单个时间点检测到ctDNA中的突变,但所有3名ctDNA阳性患者均未接受治疗或疾病进展(3/6:50%),表明BEAMing在检测活跃性疾病患者血浆ctDNA方面的价值。在另外两名ctDNA阳性IDH1突变IV级星形细胞瘤患者中,在其他时间点未检测到IDH1突变,但任何患者的MRI均未观察到肿瘤进展。在ctDNA阳性胶质母细胞瘤患者中,在放疗前未检测到两个IDH1突变,在放疗后的第二个时间点也未检测到这两个突变,但在这两种情况下,患者均存在残存疾病。然而,该患者患有低级别肿瘤,且疾病负荷远低于其他两名患者。此外,低级别胶质瘤以缓慢进展的肿瘤而闻名,因此可能是ctDNA低释放肿瘤[2,3,45]。在该患者特殊的背景下,放疗可能需要一些时间才能有效清除这一缓慢进展的低级别肿瘤。有趣的是,这位患者患II级胶质母细胞瘤已有15年历史,于2004年和2011年接受手术,贼终在2017年反复,放疗后显示含有两个IDH1突变(R132H, R132C)的活跃残余病变。这表明液体活检能够揭示肿瘤的分子异质性和进化[16,21]。实际上,虽然R132H突变在肿瘤和血浆中的VAF均高,但另一突变(R132C)的VAF在肿瘤和血浆中都较低但可检测——高于NGS和BEAMing的检测限。尽管肿瘤靶向药物基因检测的患者未接受任何IDH抑制剂治疗,但这一发现与其他研究者的报道一致,他们描述了接受选择性IDH抑制剂治疗的IDH突变白血病出现其他IDH突变作为耐药机制;这表明新发生的耐药突变或扩增存在但为亚克隆的IDH突变[46,47]。由于肿瘤靶向药物基因检测仅研究了肿瘤体细胞改变,没有进行体细胞DNA研究或进行单细胞分析,因此肿瘤靶向药物基因检测无法证明该患者IDH1中的两个共存突变是否属于同一个克隆或两个不同的克隆。然而,考虑到原发肿瘤中每个突变的VAF差异很大,以及仅在血浆中检测到一个突变(R132C),该患者存在同型合子IDH1突变克隆的可能性很小。如果该肿瘤细胞克隆为同型合子,具有两个不同的IDH1突变等位基因(R132H和R132C),则两个突变在肿瘤和血浆中的VAF应相似。此外,IDH突变肿瘤需要呈杂合子,以促进α-酮戊二酸向肿瘤代谢产物(R)-2HG的转换[5,7]。因此,在肿瘤靶向药物基因检测的患者中,更可能的是R132H突变属于优势IDH1突变克隆,R132C对应于一个亚克隆细胞 Population。据肿瘤基因检测，肿瘤基因解码的研究是一份报道在胶质瘤患者组织中检测到两个共存的IDH1突变,也是一份检测到7年前在组织中亚克隆检测到的IDH1突变在血浆中的延迟出现。考虑到胶质瘤中不同IDH1位点或IDH1和IDH2位点的IDH共存突变是极其罕见的事件,肿瘤基因检测的发现对该领域具有特殊意义。的确,Hartmann等人在对747例IDH突变型胶质瘤的研究中,仅发现4例患者存在两个IDH1和IDH2共存突变,而没有发现两个或多个IDH1共存突变的病例。

肿瘤靶向药物基因检测的研究受样本量小和部分患者采血次数少的限制,这可能检测到一些患者的IDH1突变。此外,肿瘤靶向药物基因检测无法研究胶质瘤中约10-15%的IDH2基因的ctDNA突变,尽管原发肿瘤中没有患者携带IDH2突变。大多数(83%)在NGS-IDH1突变患者中进行的ctDNA阴性样本是在疾病稳定或响应期获得的,这可能解释了未检测到IDH1突变ctDNA。由于本研究中用于肿瘤组织和血浆中IDH突变分析的方法不同,如果比较NGS和BEAMing在原发肿瘤中检测IDH突变的性能将非常有趣。与之前在IDH突变白血病中进行的研究相似,未来研究应该研究高敏感的BEAMing方法是否可以检测肿瘤组织中共存的克隆或亚克隆IDH突变,以及NGS未能检测但可能帮助更正确突变分型的其他基因的共存突变。由于IDH突变发生在致癌过程的非常早期,并且突变IDH可能作为致癌基因促进其他致癌基因的遗传不稳定性和突变,从而在IDH突变与野生型肿瘤之间建立明确不同的分子谱,研究血浆中的其他共存突变以提高肿瘤靶向药物基因检测研究液体活检的诊断精度将非常意议。的确,扩大研究的基因数量也可能提高检测更多胶质瘤患者肿瘤突变的可能性;这可能实现疾病监测和肿瘤异质性评估的更精细方法。贼后,肿瘤靶向药物基因检测无法在采血同时获得脑脊液样本,以研究肿瘤、脑脊液和血浆之间的相关性。