【佳学基因检测】高阶多重PCR技术是多么先进？怎么用？

实时荧光定量PCR技术，简称rtPCR,又写为RT-PCR，rt-PCR,是目前应用最广的单位点、片段级别的核酸检测技术。核酸检测是广义意义上的基因检测。实时荧光PCR，由于采用光子检测技术，可以在不开盖的情况上实时探测反应管内的化学反应情况，因此，基于此基技的基因检测可以采用闭管检测模式。相对于开管检测而言，rtPCR极大降低了扩增产物的污染机会，节省了时间和人力，同时可以实现自动化，更可以利用阈循环数（detlaCt值）支持定量检测。然而，rtPCR的一个很大局限在于单个反应所能检测的靶基因数目有限。根据目前主流荧光PCR仪器检测通道数目，单个反应所能检测的靶基因数目很难超过4-6个，限制了该技术在涉及多靶点的复杂疾病上的应用，尤其是高通量NGS技术的使用，使得这一局限性更为明显。在PCR反应后添加熔解分析步骤，可在一定程度上增加可检测靶基因数目，但是，伴随荧光探针类型的增加，荧光背景及检测成本也随之升高，尤其是，探针结合区任何核酸变异都可能引起熔点偏移，导致结果误判，使得该法对于靶标数目的提升依然受限。与那些广受瞩目的高通量检测技术相比，已有30年历史的rtPCR似乎正成为一种“低阶”核酸检测技术。

MeltArray荧光PCR是另一种PCR技术的延伸。MeltArray”的荧光PCR是高阶多重PCR技术，采用该技术，一举将荧光PCR的单管检测能力提高到一个数量级以上，并可在解决多个临床需要的基因检测需要。

MeltArray巧妙地利用了Taqdna聚合酶的5'-内切酶活性。在PCR反应中，该活性将位于引物下游的媒体探针切割，生成媒体引物和媒体引物，然后与分子信标报告探针相结合。在Taq酶聚合活性的作用下，沿着分子信标延伸生成具有特定熔点的荧光双链，最终使媒体探针具有特定熔点。由于每个分子信标允许多个媒体引物形成一系列具有不同熔点的荧光双链，单个MeltArray多个荧光PCR反应可检测的总靶基因数等于反应中分子信标数乘以其所容纳的媒体引物数。基 因解码技术人员中展示，单个荧光通道可检测12个靶标，6个荧光通道的仪器可检测多达72个靶标！这是单个闭管PCR检测的最大靶基因数量。

该技术实现的关键是获得一个具有多泊位的报告探针，以容纳大量的媒介引物。基因解码人员首先比较了线性探针和分子信标作为报告探针的优缺点，分子信标因其背景清晰而获胜。然后，基因解码实验技术工程师研究了分子信标的多泊位能力。他们小心翼翼地从两个PCR开始，首先证明一个分子信标允许两个媒介引物停泊；另一个四个PCR证明了一个分子信标允许四个媒介引物叠加停泊。因此，一个分子信标可以容纳任何多个媒介引物。根据目前荧光PCR仪器的熔点分辨率，单个荧光通道可以检测到12个靶基因。最后，研究人员建立了一个阵列结构的媒介子数据库及其相应的分子信标报告探针，以实现检测的标准化。为了减少多个PCR中引物共存可能产生的引物二聚体干扰，研究人员引入了PCR抑制的概念，提出了MeltArray的完整技术原理。

为验证MeltArray的多重检测能力，基因检测设计师首先设计了一个20重PCR的MelArray检测体系，覆盖人类Y染色体无精子因子区域(AZFa、AZFb、AZFc和AZFd)的18个序列标签位点和2个参照基因（SRY基因和ZFX/Y基因）。在正常男性样本，20个位点全部存在，即均有熔解峰，而患者男性则会出现1个或多个熔解峰的缺失——该实验是一个典型的多靶标同时出现的例子。实验结果表明，该MelArray体系仅利用三个荧光通道，就实现了20个靶标的同时检出。为评估模板量对MeltArray检测能力的影响，PCR技术分析了从100 ng到100 pg的健康男性和女性的基因组DNA，在该范围内，所有模板均被稳定检出。随着DNA模板量的逐渐降低，熔解峰高度有所下降，但20个峰的熔点值均未发生变化。最后，技术人员通过对757份样本的双盲检测，证实了MeltArray体系的准确性。

受以上结果鼓舞，工作人员开始挑战更多的靶标数目。使用六个荧光通道设计了一个62重PCR的MeltArray检测体系，用于识别61种O抗原合成基因及1个大肠杆菌管家基因yccT。我们看一下此时每个通道的检测数目，按照荧光波长从低到高的次序，六个荧光通道检测的靶标数目分别是11、9、12、12、8和10个！各个通道的重复实验结果采用3倍标准偏差显示，每一个靶标对应的熔点值均稳定且能明确区分。最后，利用该体系鉴定了167株大肠杆菌培养株的血清型，除了覆盖范围之外的4株，检测结果与全基因组测序结果完全一致，而且比传统抗血清法多鉴定出11株，还另外纠正了其鉴定错误的1株。

上述两个例子均为定性检测，那么，MeltArray可否另外进行定量检测呢？为回答这一问题，研究团队设计了一个24重PCR的呼吸道病原体检测体系（图4），他们将其中的19种非定植菌/病毒和1个内控基因设置为熔解分析模式，即定性检测；另外4种细菌设置为实时PCR检测模式——即TaqMan探针模式，即定量检测。需要指出的是，作者选择变性阶段进行实时荧光检测。他们相信，实时检测的对象是探针酶切后积累的荧光信号，无论变性阶段还是延伸阶段，检测结果应该一致。在变性阶段，任何报告探针产生的荧光都会趋于一致，而不影响实时检测结果。事实证明了作者的这一设想。该体系在定性检测19种靶基因的同时，成功实现了4种靶基因的定量检测。24重PCR的MeltArray检测体系分析灵敏度达10 copies/μl。通过对67份肺炎或呼吸道感染患者的肺泡灌洗液样本的验证，证实了检测结果的可靠性。

突变分析是核酸检测另一重要应用领域，为考察MeltArray可否用于突变分析，研究团队以KRAS突变为例，设计了一个称为“微测序”的突变鉴定体系，即在单个反应管内一一鉴定出发生在KRAS基因密码子12和密码子13上的9种类型的突变（图5）。在这里，作者利用了探针杂交的特异性，利用10条媒介探针，对上述9种突变类型和野生型分别加以二维标记。实验表明，该体系具有极佳的突变检测特异性，可耐受高达500 ng的野生型基因组DNA，可检测的突变等位基因频率达到5%-10%，优于Sanger测序——其最低突变等位基因频率在10%-20%之间，检测限低至30个拷贝每反应。最后作者利用该体系检测了167份结直肠癌组织样本的KRAS突变类型，获得了与Cosmic数据库一致的突变频率分布，同时也表明，MeltArray比Sanger测序具有更灵敏的突变检测能力。

MeltArray的以上四个应用场景，实际上对应了分子诊断的三大应用领域，即遗传病、传染病（又分别涉及到病原体鉴定及病原体定性、定量检测这些细分领域）和肿瘤的分子诊断，显示出MeltArray做为通用核酸检测技术的典型特征。当前，实现类似靶标数目的检测均需“开管检测”技术，如芯片、质谱、微球、电泳等，然而这些技术普遍存在设备昂贵，操作复杂、周转时间长等缺点，且国产化率低，在国内外市场上不温不火，长期进展缓慢。相对而言，MeltArray采用广泛可及且已国产化的荧光PCR仪器，具有明显的成本低、操作简便、自动化程度高、周转时间短等诸多优势，结合本文所展现的强大而灵活的技术优势，不仅成功推动荧光PCR这一“老技术”再上“新台阶”，也完美填补了长期存在于低阶PCR和高通量检测二者之间的技术空白！