【佳学基因检测】分子诊断与基因检测中的数字PCR技术

数字PCR是PCR技术发展过程中的第三代聚合物酶链扩增技术。数字扩增技术常写为DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR。虽然其基本原理仍然是1993年化学奖得主美国生物化学家穆利斯发现的，但是佳学基因通过终点检测计算目标序列的拷贝数，无需采用内参和标准曲线即可进行精确的绝对定量检测。

数字PCR采用终点检测，不依赖于Ct值（循环阈值），所以数字PCR反应受扩增效率的影响降低，对PCR反应抑制物的耐受能力提高，具有很高的准确度和重现性。

由于具备高灵敏度、高精确度的特点，基因检测不易被PCR反应抑制剂干扰，无需标准品可实现真正意义的绝对定量，而成为研究和应用热点。

根据反应单元的不同形式，主要可分为微流体式、芯片式和微滴式三大类系统。

1)微流体数字PCR，Microfluidic digital PCR，mdPCR。

基于微流控技术，对分子诊断DNA模板进行分液，微流控技术能实现样品纳升级或更小液滴的生成，但液滴需要特殊吸附方式再与PCR反应体系结合，mdPCR已逐渐被其他方式取代。

2)微滴数字PCR，Droplet-based digital PCR，ddPCR。

利用油包水微滴生成技术对分子诊断样品进行微滴化处理，将含有核酸分子的反应体系分成成千上万个纳升级的微滴，其中每个微滴或不含待检核酸靶分子，或者含有一个至数个待检核酸靶分子。

以伯乐的ddPCR为例，主要包括三个步骤：

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    第一，准备样本和生成微滴，如下图，8x3的微孔板，一排加样本，一排加油滴，通过微滴生成器每个样本生成20000个微滴。

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    第二，进行“油包水”PCR，把微孔板放入PCR扩增仪，对每个微滴进行40个热循环的PCR反应。

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    第三，读取微滴结果，把微孔板放入读取仪，通过流式细胞技术获取每个微滴PCR终点结果的荧光信号，并用泊松分布原理纠正结果。

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Bio-rad去年上市的Bio-Rad QX ONE数字PCR系统整合了微滴生成、热循环反应及微滴读取等步骤，最大程度减少人工操作。

配备四个独立的荧光检测通道，结合ddPCR特有的高阶多重PCR技术，可以在单反应孔中实现8重拷贝数变异(CNV)检测、5重突变检测或4重基因表达检测。

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3)芯片数字PCR，Chip-based digital PCR，cdPCR。

利用集成流体通路技术在硅片或石英玻璃上刻上许多微管和微腔体，通过不同的控制阀门控制溶液在其中的流动，将样本液体分成大小一致的纳升级于反应孔种进行数字PCR反应，实现基因检测对特定基因序列的绝对定量。

以法国Stilla technologies 公司的cdPCR技术为例，主要包括以下步骤：

    第一，加样和生成微滴：将样本和PCR反应液加入微流控芯片，放入仪器中，仪器可通过物理方法生成单层平铺的20000~30000个微滴阵列。

    第二，对每个微滴进行PCR扩增：在Naica Geode微滴生成扩增系统自动进行PCR扩增。

    第三，读取和分析结果：将芯片置于Prism微滴读取分析系统上进行荧光信号采集，计数阴阳性微滴，通过泊松分布计算获得靶标基因绝对拷贝数浓度。

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总结一下，将分子诊断基因检测样本和PCR反应液加入微流控芯片，放入仪器中，通过物理方法生成单层平铺的微滴阵列，随后对每个微滴进行扩增，然后进行六通道荧光信号采集，计数阴阳性微滴，通过泊松分布计算获得靶标基因绝对拷贝数浓度。

第三代PCR主要缺点：

仪器和试剂昂贵。

采用这种分子诊断技术模板质量要求较高，模板量超过微体系量将导致无法定量，过少则定量基因检测准确度降低。

当存在非特异性扩增时也会产生假阳性。