【佳学基因检测】耳聋的基因检测与基因矫正治疗

听力损失是一种非常普遍且使人衰弱的感觉障碍，影响着全球大约五分之一的人口。在大多数先天性听力损失患者中，基因突变导致该疾病。直到最近，听力损失患者的治疗选择仅限于助听器和不同类型的听觉植入物。然而，经过多年深入的基础和转化基因治疗实验，基因治疗策略现在正在临床试验中进行基因治疗实验。初步结果显示，接受治疗的患者的听力显著改善，凸显了基因治疗作为某些形式的遗传性听力损失的有希望的治疗方法的作用。在本文中，佳学基因矫正服务团队概述了遗传性听力损失和内耳基因治疗基因治疗实验，包括已在动物模型中建立的相关策略，这些策略很可能很快会在人类患者身上进行基因治疗实验。此外，佳学基因矫正服务团队总结并阐述了最近完成和正在进行的临床试验的新发现，并讨论了未来需要克服的障碍，以实现内耳基因治疗的广泛和安全的临床应用。

基因治疗是一个总称，涵盖了旨在改变基因表达或改变活细胞的生物学特性和功能的各种治疗方法。这些目的通常是通过使用载体将遗传物质转移到相应的靶组织中来实现的，在靶组织中，传递的核酸序列被转录和翻译，随后发挥所需的治疗效果。这些包括替换缺失的基​​因、调节基因表达，以及编辑、替换或删除特定的基因序列。

2.1 基因治疗载体

为了实现基因治疗的上述目标，必须将遗传物质或工具转移到目标组织或细胞中。目前已发现、基因治疗实验和使用多种载体用于此目的，这些载体大致可分为病毒载体和非病毒载体（表1）。

对于基于病毒载体的基因治疗，转基因被包装到病毒衣壳中，从而便于递送到靶细胞中。内耳基因治疗中使用的病毒载体最常见的是腺病毒、腺相关病毒 (AAV) 或慢病毒 (LV)。这些载体能够有效地转导广泛的靶细胞，具有可修饰的衣壳，并在短期和长期内表现出较高的转导效率。在大多数内耳基因治疗策略中，AAV 已成为首选载体，因为它们具有低免疫原性、能够永久转导有丝分裂细胞和静止细胞，并且其可修饰的衣壳可为特定靶细胞提供定制载体。然而，病毒载体在不同程度上也存在一些可能的缺点，如载量有限、临床应用中存在安全问题、临床级病毒载体生产成本高，以及（尤其是在 LV 的情况下）存在病毒脱落和插入诱变的风险。或者，可以使用非病毒载体进行转基因转移。这些载体由合成颗粒（如脂质体或聚合物）、无机颗粒（如金或硅酮）或通过物理方法（如电穿孔或声穿孔）运输的裸露 DNA 组成。非病毒载体可以提供短期转导效应的可能性，这在转移基因编辑蛋白时尤其可取。此外，它们可以经过工程改造以拥有更大的转基因载量，并且原则上易于且廉价地生产。最后，与病毒载体相比，这些非病毒载体可能表现出更好的安全性，尽管这通常是以显著降低的转导效率和细胞特异性为代价的。

2.2 载体输送至耳蜗的路线

内耳是中枢神经系统的一部分，血迷路屏障将其与体循环隔开，限制大分子从血液进入内耳。此外，内耳位于颞骨（人类最致密的骨骼）深处，限制了对耳蜗的物理接触，限制了可安全注入内耳的液体量。因此，有效向耳蜗输送药物和载体通常基于不同的局部应用技术。

目前已建立了若干种在啮齿动物和非人类灵长类动物 (NHP) 中安全可靠的载体递送技术 (图1 )。尽管全身递送是一种技术简单且侵入性低的方法，但由于上述内耳的隔离，其疗效受到严重阻碍，并且在载体递送后存在潜在脱靶效应的风险。然而，局部应用技术可以有效地将大量载体直接递送到内耳。这些包括应用于鼓膜 (经鼓室) 或中耳 (鼓室内)，这两种方法都依赖于载体随后在内耳中和内耳内的被动扩散，因此经常会出现分布问题并且无法达到预期目标。或者，基因治疗载体常规直接注射到内耳的液体隔室中，使用自然入口点，如镫骨足板或圆窗膜，或内耳的人工手术开口，例如耳蜗（耳蜗造口术），或前庭系统的椭圆囊或半规管（管造口术）。结合这些输送方法，在圆窗膜注射后在镫骨足板或半规管中形成一个通气孔，可以防止耳蜗内压升高，同时形成浓度梯度，确保载体沿整个耳蜗长度均匀分布。最后，在啮齿动物、灵长类动物以及可能大多数人类患者中，将载体注射到脑脊液中也能导致耳蜗细胞的转导，因为耳蜗导水管连接蛛网膜下腔与耳蜗内周围淋巴腔 。

局部载体输送策略概述。局部输送技术包括经鼓室 (TT) 输送至鼓膜、鼓室内 (IT) 注射至中耳、经圆窗膜 (RWM；黄色)、耳蜗造口术 (CoS) 或耳蜗管造口术 (CaS) 进行耳蜗内输送，以及经脑脊液 (CSF) 经耳蜗导水管 (CA) 输送。用红色和绿色箭头表示镫骨足板 (蓝色) 上的通风孔的用途和机制，以便沿耳蜗均匀分布。

由于受影响基因和细胞的异质性以及引发的疾病机制，已经建立了各种不同的载体、递送方法和治疗策略来治疗遗传性听力丧失（HL)。根据由（单基因）突变引起的潜在致病机制，可以采用不同的基因治疗策略。在大多数常染色体隐性遗传病中出现的功能丧失变异的情况下，基因替换/增强策略可以引入完整的基因拷贝，从而恢复受影响蛋白质的自然功能。这种策略也可用于单倍体不足的功能丧失突变的显性遗传病。在显性遗传病中，无论是显性负突变还是功能获得突变导致蛋白质功能受损或异常，基因抑制策略可以在信使 RNA 水平上抑制突变蛋白质的翻译，从而恢复正常功能。最后，可以通过基因编辑策略在 DNA 水平上纠正基因突变，这可以用于上述所有致病机制。

3.1 基因替换/增强

基因置换或增强疗法旨在通过提供常规基因拷贝来引入功能性蛋白质，以应对常染色体隐性遗传或单倍体不足显性遗传疾病中出现的功能丧失性突变。由于常染色体隐性突变在遗传性听力丧失（HL) 中患病率很高，并且治疗策略相对简单，因此目前内耳基因治疗中最常使用基因置换策略。表2概述了用于治疗遗传性听力丧失（HL) 的基因置换策略。从这些文章中可以明显看出，这些策略最常见的遗传靶点涉及耳畸蛋白 ( OTOF )、连接蛋白 26 ( GJB2 )、跨膜通道样 1 ( TMC1 )、clarin-1 ( CLRN1 ) 和连接蛋白 30 ( GJB6 ) 的突变。

3.2 基因抑制

在杂合显性突变病例中（占无综合征型HL常染色体显性遗传病例的80%），抑制或沉默突变等位基因可通过随后表达野生型等位基因恢复正常功能。为此，可以通过递送反义寡核苷酸或通过使用小干扰RNA或microRNA的RNA干扰在RNA水平上实现对异常突变的转录后抑制。这些随后抑制突变的显性等位基因信使RNA的翻译，从而使野生型等位基因信使RNA能够正常翻译成功能性蛋白质。使用反义寡核苷酸已显示可有效抑制或纠正协调蛋白（USH1C）突变中的异常剪接位点，从而导致治疗后听力水平显著提高。分别通过递送小干扰 RNA 或 microRNA抑制GJB2或TMC1的显性负突变，成功抑制了异常基因序列的翻译，随后改善了接受治疗的动物的听力功能 。表3概述了使用基因抑制策略治疗听力丧失（HL) 的临床前基因治疗实验。

3.3 基因编辑

基因编辑技术的出现开启了通过直接添加、删除或替换突变的 DNA 序列来纠正基因突变的可能性。一般来说，基因编辑使用两种不同的方法。首先，CRISPR-Cas9 系统诱导靶向 DNA 双链断裂，随后触发天然 DNA 修复机制，可利用此机制来诱导所需的 DNA 修饰。其次，碱基编辑方法通过腺嘌呤、胞嘧啶或 RNA 碱基编辑器靶向转换单个 DNA 或 RNA 碱基来促进单核苷酸改变。原则上，这两种多功能方法都可以治疗任何类型的基因突变。在听力基因治疗实验中，这些基因编辑方法已被用于纠正各种突变，包括OTOF 、KCNQ4或Usher IF 型 。此外，CRISPR-Cas9 技术也已成功生成 Usher IB 型（USH1B）的新型 NHP 模型。表4列出了使用基因编辑方法治疗遗传性听力丧失（HL) 的值得注意的临床前基因治疗实验。

基因治疗方法在临床前模型中治疗遗传性听力丧失（HL) 所取得的稳步进展和成功为转化为首次临床试验铺平了道路。到目前为止，全球已有六项临床试验由不同的利益相关方注册，包括中国复旦大学附属眼耳鼻喉医院 (ChiCTR2200063181)、再生元制药 (原 Decibel Therapeutics；NCT05788536)、礼来子公司 Akouos Inc. (NCT05821959)、Otovia Therapeutics (NCT05901480)、惠达基因治疗有限公司 (NCT06025032) 和 Sensorion (NCT06370351) 。这些试验都集中于耳蜗移植相关蛋白（OTOF）相关突变，这种突变会破坏感觉内毛细胞带状突触处的信号转导，并导致无综合征常染色体隐性耳聋（DFNB9）。

其中五项基因治疗实验采用基因置换技术，通过双 AAV 载体策略传递功能性的OTOF转基因。由于OTOF基因大约为 6 kB，完整的转基因无法装入单个 AAV 中。为了克服单个载体有限的包装能力，转基因被分成两部分，分别包装到两个不同的载体中。在由两个载体转导的细胞内，两个OTOF片段可以重建功能性转基因，实现OTOF 的完整表达 。第六项注册试验（惠达基因治疗公司，NCT06025032）旨在使用 RNA 碱基编辑方法治疗由 OTOF 基因 p.Q829X 突变引起的听力丧失（HL)病例。在动物模型中，这种方法成功地在RNA水平上诱导了腺苷到肌苷的转化，导致OTOF表达接近正常，听力改善至野生型水平。

截至撰写本文时，已有四项试验开始招募患者，其中两项试验 NCT05901480 和 ChiCTR2200063181的结果已经公布。2024 年初，Qi 等人在《Advanced Science》上发表了首批初步数据，这些数据来自 NCT05901480 试验中成功使用双 AAV- OTOF 治疗的两名儿童（分别为 5 岁和 8 岁；随访时间分别为 3 个月和 2 个月）。这些结果是首次发表的数据，不仅为了解人类耳蜗基因治疗的安全性提供了依据，而且还表明耳蜗基因治疗后的听力恢复可达到生理水平（在较年轻的单侧注射患者中）和听力水平，可以使用传统助听器（在较年长的双侧注射患者中）。年龄被认为起着重要作用，因为动物基因治疗实验总体表明，注射越早，长期功能结果越好。

不久之后，Lv 等人在《柳叶刀》上发表了首批病例系列基因治疗实验，其中包括 6 名单侧接受双 AAV1-hOTOF 治疗的患者。与上述文章（仅在《柳叶刀》基因治疗实验前 3 周发表）相比，由于这项试验（ChiCTR2200063181）比《Advanced Science》上发表的临床试验早 9 个月，因此共纳入了 6 名患者，并在应用后完成了 26 周的完全随访。与 NCT05901480 试验一样，在更严重的听力丧失（HL)（或无 CI）的耳朵中，通过带有镫骨开窗的圆窗膜将载体注入耳蜗内。总体而言，6 名入选患者中有 5 名的听力在应用后 4 周开始改善，并在应用后 26 周内保持稳步改善。平均而言，通过听觉脑干反应测量确定的听力阈值在 0.5-4 kHz 时提高了 40-57 dB，这进一步提高了语音感知能力。有趣的是，在耳蜗基因治疗后听力没有明显改善的一名患者被发现在基线（1:135，而其他五名患者为 <1:5）和治疗后（1:1635，而其他四名患者为 1:1215，另一名患者为 1:135）具有最高滴度，这可能解释了治疗效果有限的原因。进一步值得注意的是，接受治疗的任何患者均未观察到严重的不良反应或剂量限制性毒性。

最近，2024 年 6 月，Wang 等人在《自然医学》杂志 上发表了五名接受 DFNB9 双侧治疗的儿科患者的首批初步数据。所有患者均被确认为双侧耳聋，入组时平均听性脑干反应听力阈值 > 95 dB。应用双侧向量后，接受治疗的每只耳朵的听力水平均有所改善，但获益程度各不相同。在随访 26 周的三名患者中，平均听性脑干反应水平为 63 dB，频率为 0.5–4 kHz。另外两名患者在随访 13 周后，听力水平平均为 70 dB。值得注意的是，所有五名患者的言语感知和声音定位能力均有所改善，并且同样未观察到严重不良事件。

除了这些已发表的数据外，Regeneron Pharmaceuticals（NCT05788536）和 Akouos Inc.（NCT05821959）进行的临床试验的新闻稿和国际会议上公布的初步数据也表明，多名患者的听力得到了恢复。因此，两名使用 Regeneron 的药物 DB-OTO 治疗的儿童和一名使用 Akouos 的 AK-OTOF 治疗的儿童的听力都有所改善  。后一位患者注射时已经 11 岁，如果满足其他标准，Akouos甚至包括年龄不超过 44 岁的成年人。Regeneron 不使用通过耳道的入路，而是在乳突切除术后进入中耳，与 CI 手术的方式相同。至少他们基因治疗实验中纳入的最初几个儿童将接受对侧植入，以便对当前的金标准和新型基因疗法进行长期的个体内比较。

总之，目前已发表 13 名OTOF相关常染色体隐性耳聋 (DFNB9) 儿童接受 AAV-hOTOF 治疗的数据。已发表的基因治疗实验极大地帮助了建立和确认耳蜗内双 AAV 介导基因治疗的安全性和有效性。长期来看，必须基因治疗实验抗 AAV NAB 和其他限制效果的因素的影响，以帮助筛选符合条件的患者。

基因疗法以无数方式革新了医学。经过多年广泛的基础和转化基因治疗实验，遗传性霍奇金淋巴瘤的基因疗法最近终于进入临床试验阶段。接受基因疗法治疗的患者的首批数据显示出非常有希望的结果，如上文所述，听力显著改善，安全性极佳。尽管有这些令人信服的报告，但内耳基因疗法在临床实践中的广泛应用仍有几个障碍需要克服。

到目前为止，对于入组患者，仅公布了治疗后半年内的有限随访数据，尽管会议上展示了长达 12 个月的稳定结果。但目前仍不清楚患者的听力是否会以及如何长期发展，以及患者的听力是否会进一步改善、保持稳定或由于传导减少而再次恶化，可能需要重复载体给药。然而，之前使用 AAV 介导的基因治疗治疗其他疾病（包括脊髓性肌萎缩症、遗传性视网膜营养不良症、血友病 A 和 Leber 遗传性视神经病变）的经验已经在数年的随访中证明了强大的传导、有效性和安全性，这为内耳基因治疗取得类似的良好结果带来了希望。

在用OTOF诱导的 AAV治疗的大多数患者（n = 18 只耳朵）中，听力都有明显改善。然而，在一名患者中，仅检测到有限的听力恢复，这可能与抗 AAV NAB 滴度增加有关 。由于 AAV 是自然存在的，相当一部分人类都接触过这些病毒，因此也拥有针对野生型 AAV 的预先存在的循环 NAB，而地理位置会影响对特定血清型的 NAB 的接触和产生。人们对免疫特权组织中 NAB 的存在知之甚少，到目前为止，对于抗体在内耳或其液体、内淋巴和外淋巴中的作用一无所知。然而，有证据表明，NHP 和人类中枢神经系统内的 NAB 滴度与全身滴度无关，因此在适当的局部递送后，对 AAV 介导的基因递送的缓解作用可能较小。此外，已经提出了几种策略，可以帮助减少病毒载体给药后的免疫反应。首先，应用高剂量的载体或诱饵衣壳可以使 NAB 饱和，从而使足够治疗剂量的载体保持循环；然而，这种方法可能与其他缺点相关，例如增加制造成本、总免疫原性负担以及可能对背根神经节产生毒性。其次，改变载体可能有助于逃避 NAB 的中和作用。这可以通过将载体血清型转换为血清流行率较低的血清型、对病毒衣壳进行化学修饰或通过定向进化人工设计新血清型来实现。然而，这些改变可能会降低载体的向性和 / 或转导效率，同时它们仍可能因 NAB 的交叉反应而被中和 。最后，可以通过血浆置换、减少抗体计数或免疫抑制等方式减少 NAB 或其功能；所有这些都需要对可能产生的重大副作用进行细致的风险收益评估。

如上文简要提到，正确把握基因治疗时机是影响遗传性听力丧失（HL) 听力结果的另一个因素。在大多数临床前小鼠基因治疗实验中，治疗通常在出生后几天内进行 — — 甚至在子宫内进行（表2、3 和 4 ）。比较小鼠和人类内耳的发育情况，存在很大差异，因为小鼠在出生后约 2 周开始有听力，而人类的听力在妊娠第 20 周左右完全发育 [ 158 ]。因此，关于成熟动物基因治疗后结果的数据相当稀少，部分表明年龄较大时结果更差 。此外，一些基因治疗实验报告了 NAB 滴度与年龄相关的变化，其似乎在出生后下降，在 6 至 12 个月龄之间达到最低点，随后在 3 岁后再次上升 。最后，从对先天性耳聋儿童进行人工耳蜗植入的基因治疗实验可知，长期感觉剥夺后，中枢听觉系统会逐渐丧失可塑性]。因此，中枢听觉通路保持完全可塑性约 3.5 年，之后再保持混合可塑性 3.5 年，之后神经可塑性显著降低。到目前为止，接受治疗的 13 名儿童中只有 5 名（38.5%）年龄差距在 6 个月和 3 岁之间。然而，从迄今为止发表的数据可以明显看出，年龄较大的儿童也可以从基因治疗中受益匪浅，这促使人们考虑基因治疗可能对年龄产生限制作用，而这将必须针对所有基因突变单独确定。

此外，必须考虑到，治疗不同的基因突变需要针对不同的细胞结构。为此，必须选择或独特设计特定的载体，以允许对某些细胞进行靶向转导。在OTOF突变的情况下，适当的载体必须转导耳蜗内毛细胞，而耳蜗内毛细胞是 otoferlin 在突触传递中发挥关键作用的地方。虽然有几种载体能够做到这一点，但两种常用于转导其他靶标的载体是 AAV9-PHP.B 和 Anc80L65，它们都是合成的 AAV 变体 。AAV9-PHP.B 以前曾因其在 C57BL/6 小鼠中穿过血脑屏障的能力而被基因治疗实验，后来才发现它也能有效转导其他小鼠品系和 NHP 的内耳细胞。相反，Anc80L65 最初被发现能转导小鼠的内毛细胞和外毛细胞，但将该载体应用于 NHP 仅显示出对内毛细胞的有效转导 。这些例子强调了需要合适的载体以及在适当的大型动物模型中进行基因治疗实验。此外，还必须根据各自的安全性选择载体。虽然这在 AAV 中不是问题，但其他病毒（尤其是 LV）在应用于人类时通常具有显著的致病性。因此，新型 LV 的设计方式可以降低风险（包括插入诱变），同时还可以改善耳蜗细胞内的转导。

此外，由于存在不同的潜在发病机制，例如毛细胞退化，治疗OTOF突变的成功可能不适用于其他遗传性听力丧失（HL) 疾病。内耳被包裹在身体最硬的骨头之一中，打开包围感觉细胞的耳囊通常会导致失聪，这使得无法简单地获得揭示细胞完整性当前状态的活检。因此，最相关的信息可以从患有特定疾病的患者的颞骨尸检样本中获得。这些样本的大量收集位于世界各地的少数几个中心，并且通常无法推断出某个年龄的剩余毛细胞数量。这凸显了对遗传性听力丧失（HL) 进展进行“自然史基因治疗实验”的必要性。由于成熟的哺乳动物毛细胞缺乏再生能力，出生时的治疗可能会错过某些疾病的适当机会窗口，因为没有可治疗的细胞残留。一些临床前基因治疗实验报告了诱导有丝分裂再生或耳蜗支持细胞转分化为毛细胞的可能性]。然而，这些再生的毛细胞很少完全成熟，并且可能缺乏螺旋神经节神经元的再支配，从而使这些毛细胞失去功能。在人类中，近几年已启动了基因治疗实验再生方法的临床试验。然而，这些试验未能恢复或改善接受治疗的患者的听力。

然而，基因疗法也可用于优化现有技术（如人工耳蜗）的效果。光遗传学人工耳蜗植入是一种尝试在螺旋神经节神经元表面表达视蛋白（一种特殊的感光蛋白）的策略 ]。虽然早期实验集中于通过耳蜗造口术改善激光刺激，但最近的基因治疗实验已经证明了基于柔性 µLED 阵列在几种不同动物模型中实现多通道人工耳蜗的可行性。此外，也有人推测神经营养因子基因疗法可以通过促进对螺旋神经节神经元的刺激来潜在地改善人工耳蜗的效果。

最后，还必须考虑适当的策略以有效地将载体输送到内耳。如上所述，局部输送方法已被证实是将载体输送到内耳的最有效策略，但也可能存在风险，包括损伤内耳的感觉结构，例如通过增加耳蜗内压力或仅仅通过打开耳蜗。因此，可以进行几种变化，包括手术方法或注射部位和细节。根据后者，必须选择不同的途径：例如，耳后入路最适合于应用于侧半规管，而经耳道/耳内入路可以以较小的侵入性进入圆窗和卵圆窗。最后，使用不同的应用设备（如微针或导管系统）可能有助于最大限度地减少应用过程中的创伤，并优化沿耳蜗的载体分布 。

在人体基因治疗实验中，还有待确定的是评估治疗成功的最相关参数。虽然纯音听力图是最广泛使用的临床工具，但有人对其预测内耳细胞损伤的有效性表示怀疑 [182 ]。虽然成年人可以接受大量的听力测试，并且成人人工耳蜗植入的最低限度言语测试组合已经使用了很多年，但可以对儿童进行的测试更为有限，并且上述当前治疗黄金标准和新治疗方案的个体内比较将非常重要，当这些孩子长大到可以接受更先进的患者报告结果和经验测量的评估时 [ 183 ]​​。总体而言，虽然仍有许多变量有待确定和优化，但最近的发展表明内耳基因治疗前景光明。