【佳学基因检测】多基因检测血液分析在神经内分泌肿瘤诊断和治疗中的临床应用

神经内分泌肿瘤疾病的当前临床状况

神经内分泌肿瘤 (NEN)，也称为神经内分泌肿瘤 (NET)，通常称为“类癌”，代表一系列具有多种分子异常的肿瘤，这些异常具有共同的神经内分泌细胞起源(表格1）。在解剖学上，病变起源于肺、胃肠道和胰腺的弥漫性神经内分泌系统以及离散器官部位，例如胸腺、垂体和肾上腺。在功能上，它们产生多种生物活性胺和肽。正如可以预测的那样，鉴于所涉及的细胞和肿瘤类型不同，它们的 5 年生存率与其临床表现的差异一样大（15%–95%）。总体而言，这反映了肿瘤的生物异质性（不同的细胞类型、不同的分子调控机制和不为人知的致癌驱动因素），实际上，这表明这些肿瘤通常与它们假定的共同起源细胞之间几乎没有关系. 

表格1:神经内分泌肿瘤生物标志物的生物学和临床应用

a仅对症治疗。

b仅在特定情况下，例如胃泌素瘤/胰岛素瘤。

c检测技术识别 EPCAM（上皮细胞粘附分子）。

他们的管理反映了通常基于当地实践经验、卓越医学或某些疗法或药物研究的可用性的各种方法。尽管分类系统和令人厌烦的指南不断发展（例如，世界卫生组织和欧洲神经内分泌肿瘤学会），很少有基于证据的标准化方法，特别是对于惰性疾病或适当的治疗顺序。大多数研究都是回顾性的，动力不足，并且表现出明显的设计缺陷。除了早期发现的（通常是偶然发现的）阑尾、直肠或胃 NET 外，治愈并不常见，绝大多数管理方法反映了多种策略组合，以试图延缓局部或转移性疾病进展并抑制临床症状。对于那些具有惰性肿瘤行为或有稳定疾病证据的患者，一些医生认为采取观察和等待策略是合适的。目前的治疗策略包括生长抑素受体激动剂和拮抗剂、靶向药物（雷帕霉素抑制剂和血管内皮生长因子拮抗剂的哺乳动物靶点）、免疫治疗（干扰素）、细胞毒化疗、肽受体放射性核素治疗（PRRT）、外照射和介入放射治疗。或探针定向消融。管理选择通常基于当地经验、当前正在进行的药物试验和多学科肿瘤委员会的组成，而不是对肿瘤分子生物学的描述。在缺乏对个体肿瘤基因组基础的最先进评估和系统生物学技术应用来推进疾病知识的情况下，相对简单的分级和分期分类往往会推动大多数决策。

疾病状态界定的局限性

通过影像学、生物标志物水平、症状学和无进展生存期 (PFS) 评估的持续评估是 NEN 管理策略所依据的基本基础。通常，疾病的复发、进展或治疗效果的缺陷是使用解剖学/形态学和功能成像的合并来定义的，其中插值了症状学的改变和生物标志物的扰动。使用实体瘤反应评估标准 (RECIST) 的解剖成像具有充分证明的局限性，包括次优的可重复性、对靶向治疗的疾病反应性的解释不敏感，以及在识别转移性疾病方面的判别指数相对较低。使用基于生长抑素受体策略的功能成像，例如68 Ga-生长抑素类似物 (SSA) PET/CT，具有相当大的价值但空间分辨率有限（PET 扫描仪为几毫米），部分体积效应限制了描绘小体积的能力病变。尽管新病变的发展可能是疾病进展的最有力指标，但使用影像学监测治疗效果和早期发现残留或进展性疾病仍然具有挑战性并且不是最理想的。目前使用的生物标志物是分泌性单分析物（胃泌素和胰岛素）、蛋白质共分泌产物（嗜铬粒蛋白 A [CgA]）和尿中降解胺（5-羟基吲哚乙酸 [5-HIAA]），它们通常具有有限的预测或预后价值.

当前生物标志物的局限性

生物标志物是诊断疾病和监测或预测疾病治疗结果的工具。它们是可在生物介质（例如组织、细胞或体液）中测量的细胞、生化或分子变化。NEN 将生物活性产物（包括胺和肽）分泌到循环中，这些产物是可检测和可量化的。这些包括特定于单个细胞类型的分析物，例如胃泌素（胃泌素瘤），以及所有 NEN 共有的共分泌产物，例如 CgA 或神经元特异性烯醇化酶。

CgA 是神经内分泌细胞分泌颗粒的组成产物，可在血清或血浆中测量。它可能与肿瘤块相关并且似乎作为预后剂起作用。然而，小肿瘤可能分泌过多，而大肿瘤可能表现出低分泌。特异性受体靶向剂，例如 SSA，通过抑制合成和分泌机制来减少 CgA 的分泌。CgA 的敏感性范围从 60% 到 90%，特异性小于 50%（取决于所研究的人群）。CgA 与成像无关，尤其是68Ga-SSA 和氟脱氧葡萄糖 F 18 成像，其在 CT 或 MRI 中的应用仍有待确定。通过循环 CgA 水平的变化来衡量对治疗的生化反应通常也与基于图像的评估不一致。较差的实验室指标、非特异性和诊断不准确进一步导致对其临床实用性的低热情。这些限制强调了对替代工具的需求，例如 microRNA (miRNA) 或循环肿瘤细胞 (CTC)，或信息分子工具，例如描述疾病状态重要生物学特征的多分析物生物标志物。目前，miRNA 的测量仍然很复杂，并且没有充分标准化以供临床使用。CTC 虽然直观地作为肿瘤细胞相关事件的直接测量具有吸引力，但迄今为止未能提供广泛临床应用的证据。基于血液衍生基因组信息的肿瘤行为动态表征只能来自循环实时多分析物遗传信息的评估（NETest，Clifton Life Sciences，Nevis）（见表格1）。基于血液的转录组分析和对肿瘤特定基因组驱动因素的询问提供了液体活检，这是实时评估肿瘤状态的最佳平台。

分子生物标志物的基本原理

癌症生物学行为和对治疗的反应的复杂性和多样性不能通过分泌产物的测量来充分定义。胞吐和分泌蛋白的测量不能充分捕捉活性肿瘤细胞的生物活性，包括增殖、代谢活性、生长因子信号传导等。因此，不同肿瘤学科的临床科学家得出的结论是，通过对肿瘤的分子基因组机制进行多维评估，可以最好地评估不断发展的肿瘤的分子生物学地形的动态和全景描绘，即癌症的标志。细胞。这包括 mRNA 和 DNA 的测量以及突变状态的描述，以及系统生物学在识别主调控因子和致癌检查点中的应用。因此，重点关注分子技术的应用，以更好地定义癌细胞状态，同时关注突变的检测（通常在循环肿瘤 DNA [ctDNA] 或转录谱中，包括 mRNA 和信号通路分析）。基于肿瘤组织的 mRNA 方法的应用实例包括 MammaPrint（Agendia，Irvine，California），这是一种 70 基因检测，用于预测早期乳腺癌的复发风险，同时考虑辅助治疗。在考虑辅助治疗的同时对癌症复发风险进行分层的其他基因组测试有，例如，用于乳腺癌、结肠癌、前列腺癌的 Oncotype DX（Genomic Health，加利福尼亚州红木城）或 MammoStrat（Clarient Diagnostic Services，Aliso Viejo，加利福尼亚州） )，用于早期激素受体阳性乳腺癌。美国临床肿瘤学会最近对 MammaPrint 的认可突出了这些方法的临床实用性，以指导早期浸润性乳腺癌女性辅助全身治疗的治疗决策。尽管这些信息强调了基因表达测试的重要性和有用性，但这种技术目前仅限于基于组织的测试，并且需要重复活检以提供实时临床信息。

其他肿瘤的液体活检策略

然而，评估来自肿瘤的循环分子信息的策略已经发展到血液采样可以提供大量肿瘤学信息的地步。在肿瘤学领域，人们对此类策略或液体活检的识别和应用非常感兴趣（图1）。在这方面，循环肿瘤分子特征，即循环​​ Mammaprint 样特征，将具有限制侵入性活检、定义治疗目标和提供实时监测工具以评估疾病状态的临床效用。

图1:与“液体活检”相关的出版物 (PubMed) 或网络焦点 (Google Trending) 的数量。2004 年最初注意到公众的重大兴趣，并自 2012 年以来有所升级。学术兴趣最初滞后，但随后从 2012 年开始升级。尽管医学科学界似乎不如公众接受，但对这两个领域的兴趣呈指数级增长。

鉴于组织活检的侵入性和技术限制，人们更加热衷于开发可以在血液中实时量化的替代标志物。研究的重点是测量循环遗传信息，例如 ctDNA、RNA 或肿瘤细胞，或识别可操作的突变事件，例如 ctDNA 中的BRAF突变。因此，液体活检的使用允许对患者进行分层（例如，作为伴随诊断）以进行筛查和监测治疗反应。例子包括 ctDNA 中 T790M 突变的鉴定，它可以监测肺癌对 EFGR 抑制剂的治疗反应。ctDNA 水平的测量已用于检测手术/复发后的微小残留疾病，例如结肠癌。然而，与大多数癌症不同，激活突变在 NENs 中是不常见的，如果不是在很大程度上是未知的，并且大多数肿瘤在肿瘤抑制基因中表现出体细胞突变（当被识别时），例如MEN-1，主要的胰腺突变。其他改变的临床有用性，例如ATRX、DAXX或YY1 （均被确定为胰腺 NEN 中的散发性突变）仍有待证明。此外，拷贝数和染色体失衡以及基于化学的 DNA 修饰（例如甲基化）的临床用途需要阐明。迄今为止，测量分子信号（例如 ctDNA、甲基化基因靶标或 CTC）的临床应用在 NEN 中受到限制。因此，NEN 的重点已转向基于 mRNA 的液体活检方法，该方法已被证明可用于其他疾病。例如，FibroSure/FibroTest（BioPredictive SAS，巴黎，法国）是一种基于血液的生化算法测试，用于检测丙型肝炎。FibroSure 是一种可重复的非侵入性测试，被认为具有高精度减少与肝活检相关的不适或并发症的附加价值。

NETest 的科学基础

已证明基于转录组的评估可用于识别和区分 NEN 的不同亚型（基于起源 [例如，胰腺与小肠] 和侵袭性 [例如，非进展性与恶性/转移性]）。这些基于mRNA的评估在组织水平上也具有可证明的预测效用。肿瘤组织的转录谱已经确定了一系列在循环中可检测到的神经内分泌转录物，并且可用于临床评估胃肠道、胰腺和支气管肺 (BP) NEN。这一策略也被用于定义起源于神经系统的肿瘤，包括副神经节瘤和肾上腺，即嗜铬细胞瘤。这种基于血液的多分析物转录物分析是针对此类肿瘤的最广泛研究的液体活检工具。

通过分析来自新鲜冷冻肿瘤和全血的细胞谱的微阵列数据集选择单个基因（3 个微阵列数据集：肿瘤组织 [n = 15]、外周血 [n = 7] 和腺癌 [n = 363肿瘤]）以确定表达模式的相似性（图 2）。一旦确定，就对正常组织基因表达进行共表达网络推断，以消除不太可能与肿瘤相关的基因。来自其他肿瘤类型（例如乳腺、结肠等）的肿瘤相关基因同样被排除在外；在外周循环中可检测到的 51 个候选标记基因被鉴定为包含 NEN 的标志。然后在 130 个血样（NEN：n = 63）的训练集中检查候选基因特征，并在 2 个独立集（集 1 [NEN：n = 72] 和集 2 [NEN：n = 58]）中进行验证。匹配的血液/肿瘤的相关性分析认为这是非常显着的（R 2 = 0.62-0.91；P<.0001)，表明基于血液的测量直接归因于肿瘤基因表达特征。

图 2:用于推导一组标记基因的计算管道，即识别血液中 GEP-NEN/NET 疾病的 NET 标记面板。步骤 1：从 2 个独立数据集（GEP-NEN-A 和 GEP-NEN-B）推断的基因共表达网络相交以产生 GEP-NEN 网络。步骤 2：来自肿瘤和正常组织微阵列数据集的共表达网络被组合以产生正常和肿瘤网络。第 3 步：从 GEP-NEN 网络中减去存在于正常和肿瘤网络中的链接。第 4 步：将 GEP-NEN-A 和 GEP-NEN-B 数据集 (n = 21) 中的上调基因映射到共识 GEP-NEN 网络。步骤 5：鉴定 GEP-NEN 血液转录组和 GEP-NEN-A 和 GEP-NENB 数据集中一致上调的基因，提供了 32 个推定基因。第 6 步：文献整理和癌症突变数据库搜索产生了另外一组 22 个推定的标记基因。在描绘最终的 NET 标记面板之前，总共分析了 75 个标记基因。第 7 步：最终的 NETest 液体活检包括 51 个标记基因，这些基因在 3 个独立队列中得到验证，总共 193 个 NET 和 172 个对照。RT-PCR，逆转录PCR。(改编自Modlin I、Drozdov I、Kidd M。通过血液中的多重同步转录分析鉴定肠道神经内分泌肿瘤疾病。公共科学图书馆一号 2013；8:e63364；经许可。）

签名——NETest——可以识别所有类型的 NEN，包括小的非转移性肿瘤。这种敏感性使得肝脏中的图像阴性病变可以被识别并随后通过微观肿瘤沉积物的组织学证明得到证实。与其他 NET 生物标志物的比较评估表明，它显着优于基于单一分析物的检测分析。此外，水平与临床状态相关，例如疾病稳定或进展。数学分析表明，该技术在 NEN 诊断方面优于单一分析物检测。例如，基于 NEN 基因的分类器的曲线下面积 (AUC) 为 0.95 至 0.98，而 CgA 为 0.64（Z 统计量 6.97–11.42；P <.0001）。与其他常用生物标志物相比，如胰抑素和神经激肽 A（AUC：0.58–0.63），NETest AUC 为 0.98（面积差异：0.284–0.403，Z统计量 4.85–5.9；P <.0001）。NETest 的实用性通过使用预测特征分析在数学上得到证实，该分析确定与测量单个分泌产物（CgA：13%；胰抑素：9%；和神经激肽 A：9%）。

NETest 的数学基础

该测试使用 2 步方案（mRNA 分离、cDNA 生产和聚合酶链式反应 [PCR]）从EDTA收集的全血（图 3）。51 种标志物的血液基因表达对管家进行标准化，并相对于群体对照进行量化。基因表达水平与使用监督机器学习算法的结果相关，包括支持向量机和线性判别分析，这两种算法都已广泛应用于临床医学。这些算法使用基因表达水平来了解样本是否应归类为肿瘤或对照。随后使用独立的测试集验证算法性能。

图 3:用于为 GEP-NET 提供多分析物基因表达面板的多步骤协议。在定量 PCR 基因表达之前进行两步方案（mRNA 分离和 cDNA 合成）。使用看家基因表达对 mRNA 水平进行标准化。然后使用 2 个单独的数学算法分析来询问归一化的 51 标记签名。这提供了两个读数。第一个生成一个分数，用于识别样本是 NET 还是非 NET（分数 0-8）。得分为 0 到 2 的样本被归类为正常，3 到 8 的样本被归类为 NET。第二个分析评估了与生物学相关的 NET 通路相关的特定基因簇的表达。大于或等于 50 的组学值具有大于 75% 的识别进行性疾病的概率。这 2 个信息集浓缩为一个分数，从 0% 到 100%（NETest 分数）。基于分类得分加权（分析 1）进行缩放，生物基因表达与疾病状态相关（分析 2）。NETest 描述了特定患者的肿瘤是否属于疾病活动的低风险 (<40%)、中等风险 (40%–79%) 或高风险 (≥80%) 类别。HRS，小时；qPCR，定量 PCR。或疾病活动的高风险（≥80%）。HRS，小时；qPCR，定量 PCR。或疾病活动的高风险（≥80%）。HRS，小时；qPCR，定量 PCR。

NETest 使用 4 种不同的数学工具：支持向量机、线性判别分析、k-最近邻和朴素贝叶斯算法。使用包含 130 个血液样本的训练集（NEN：n = 63 和对照：n = 67）来教授（或训练）这些，并在 2 个独立的集合中验证（或测试）（第 1 组 [NEN：n = 72，对照： n = 43] 并设置 2 [NEN：n = 58；控制：n = 62]）。所有算法都旨在区分对照与肿瘤以及稳定疾病与进展性疾病。首先，每个算法将未知样本标记为 0 或 1，分别对应于对照或肿瘤的预测。然后，将预测应用于肿瘤样本，将它们标记为 0（稳定）或 1（渐进）。此分类结果为 0 到 8 分。大于2的分数被认为是肿瘤。在测试集中，AUC 值分别为 0.98 和 0.95。该试验表现出高灵敏度（85%~98%）、特异度（93%~97%）、阳性预测值（95%~96%）和阴性预测值（87%~98%）。这些数据证实学习算法可以成功分类（并因此诊断）血液中的 NET。

为了将测试的实用性从纯粹的诊断扩展到可以捕获神经内分泌肿瘤生物学的工具，作者随后进行了监管网络分析。简而言之，这种方法涉及将 NET 特定基因映射到人类蛋白质-蛋白质相互作用的数据库，从而在它们各自的生物学功能的背景下可视化标记基因。该策略确定了 8 个生物学相关基因“组学”簇（SSTRome、增殖组、信号组、代谢组、分泌组、表观基因组、plurome 和凋亡组），它们定义了 NEN 指纹并构成了 NET 细胞的癌生物组。然后可以对 6 个簇（SSTRome、增殖组、代谢组、分泌组、表观基因组和 plurome）中基因表达的差异分析进行数学分析，以从进行性疾病中推断出稳定。这些构成了个体肿瘤生物学特征的分子表征。总体而言，该策略捕获了特定 NEN 的生物学并定义了单个肿瘤的分子状态。为了便于对该信息的临床解释，诊断分数表示为范围从 0%（低活性）到 100%（高活性）的临床活性分数。因此，高分，例如 8，组学簇中基因表达升高，被缩放到 100%（高活性）。相比之下，确定组学基因簇低表达的相同分数（8）被加权为 53%（见图 3）。在这两个例子中，样本都是肿瘤（8 分相当于所有 4 种算法 [前面讨论过]，将样本分类为肿瘤）。两个样本之间的差异反映了不同的肿瘤生物学，如组学基因簇所捕获。例如，100% 的分数比 53% 的分数识别出更具侵袭性的肿瘤表型。使用 Kaplan-Meier 分析（n = 63，时间段 60 个月），作者将临床决定因素与基因表达水平相关联。这些都是低生物活性，小于或等于40%；中等生物活性，41% 至 79%；和高（生物攻击性）活性，80% 到 100%。在 BP 肿瘤中发现了类似的范围谱。

NETest 的实验室指标

多分析物算法分析程序已经过验证，并在临床实验室改进修正案认证的临床实验室（康涅狄格州：07D2081388）中进行。批间变异性为 2.14% ± 1.14%，批内变异性为 1.02% ± 0.74%。在临床研究中，单个基因表达的测定内重现性范围为 0.4% 至 1%。PCR 循环时间、标准化基因表达和评分的评估表明相关性水平很高（Spearman >0.90）。NEN 样本的连续每日分析对得分表达的 Spearman 相关性为 0.96 ( P<.001; 变异系数<5%）。在来自大约 100 个不同机构和大约 150 名医生的大约 5500 个患者样本中评估的汇总 NETest 数据表明，该测试的日常变异性极低 (<2%)，并且该测试具有高度可重复性（样本一致性 >95 %）。

血液中 NETest 特征的测量非常可靠，不受食物摄入的影响。使用无监督的层次聚类对基因表达测量的评估未能确定喂养和基因表达之间的内在关系，并且 NETest 在测试餐后 4 小时内没有改变。年龄、性别、种族和质子泵抑制剂 (PPI) 的使用之间没有可识别的关系。后者是 CgA 测量中的一个特殊问题，因为 PPI 显着提高了 CgA 水平。NETest 分数不受长期 PPI 治疗（>1 年）的影响。总体而言，该测试已被证明具有可靠的高灵敏度和特异性（均 > 95%），标准化和可重复（批间和批内变异系数 <2%）不受年龄、性别、种族、禁食或 PPI 药物的影响。

NETest 的临床应用

诊断

小肠神经内分泌肿瘤 NETest 准确识别小肠 NEN 并将其与其他小肠和大肠癌区分开来（图 4）。在 1 项前瞻性研究中，检测小肠 NEN 的准确率为 93%（所有 NETs 阳性，3 [12%] 结直肠肿瘤阳性）。CgA 在 80% 中呈阳性，但 29% (n = 7) 的结直肠癌也表现出循环 CgA 水平升高。转移性疾病受试者的基因表达评分升高（P <.05），并且比 CgA 水平（20%-32%）更准确（76%-80%）检测 NEN 疾病。总体而言，作为一项诊断测试，NETest 对小肠 NEN 的敏感性明显高于 CgA。

图 4:用于 NET 诊断和管理的多分析物检测 (NETest) 的临床应用。NETest 可识别疾病状态、检测疾病进展、预后，并可用于预测 PRRT 疗效。诊断：NETest可以检测BP NET、胰腺和胃肠道NET，准确率大于等于95%。此外，它对 PPGLs 的诊断有效（≥95%）。管理：NETest 在 3 个领域具有临床效用：（1）评估外科手术的有效性；这允许预测/识别疾病复发；(2) 评估对 SSA 或 PRRT 的治疗反应；(3) 预测治疗失败/疾病进展；可以使用 NETest 预测对 PRRT 的反应，随后测量转录水平随时间监测治疗反应。

胰腺神经内分泌肿瘤 NETest 还可用于准确确认胰腺疾病患者血液样本中的神经内分泌疾病（与其他癌症和非肿瘤性疾病 [例如慢性胰腺炎] 相比）。在 1 项研究中，准确率为 94%；6% (2/31) 的导管内乳头状粘液性肿瘤呈阳性，与报道的 NEN 和这些病变共存一致。只有 29% 的胰腺 NET 在血液中呈 CgA 阳性；CgA 的总体准确度为 56% (图 5）。

图 5:循环 NET 成绩单测量 (NETest) 与 CgA 的准确性比较。MAAA（多分析物算法分析）（NETest）在 96% 至 100% 的支气管肺、胰腺和小肠 NET 中呈阳性。相比之下，CgA 的准确度要低得多。仅约 30% 至 60% 呈阳性（升高）。在 pNETs 中，CgA 仅在 30% 的肿瘤中升高。总体而言，40% 至 70% 的 CgA 水平正常，显着限制了其作为生物标志物的临床应用。

支气管肺神经内分泌肿瘤 在来自肺肿瘤的血液中鉴定出可检测的 mRNA，其神经内分泌表型超过 90%。接受者操作特征 (ROC) 分析 AUC 为 0.99，用于区分肺类癌（典型或非典型）与对照。敏感性和特异性范围分别为 93% 至 95% 和 82% 至 93%。在具有 RECIST 定义的进展性疾病的个体中，与疾病稳定 (33% ± 17%) 或考虑手术治愈的患者 (10% ± 5%) 相比，无论组织学如何，NETest 水平均显着增加 (72% ± 23%)。与局部疾病 (45% ± 21%) 相比，转移性疾病 (63% ± 26%) 的水平更高。作为比较，血液 CgA 升高不到 50%。决策曲线分析表明，与 CgA 相比，基因表达分析的标准化临床净收益超过 75%，风险阈值高达 90%。因此，使用 CgA 作为生物标志物在不到 30% 的患者中表现出净临床益处。

副神经节瘤和嗜铬细胞瘤 神经源性病变、副神经节瘤和嗜铬细胞瘤 (PPGL) 在 100% 的病例中为 NETest 阳性。ROC 分析 AUC 为 0.98，用于区分 PPGL 与对照。尽管突变状态与血液基因表达水平没有直接关系，但转移性 (80% ± 9%) 和多中心 (64% ± 9%) 疾病的得分显着 ( P <.04) 高于局部疾病 (43% ±7%) ）。进展性疾病的得分最高（86% ± 2% vs 稳定的 41% ± 2%；P <.0001）。总体而言，NETest 作为 PPGL 的诊断测试高度敏感（>95%）。

胃肠胰和支气管肺神经内分泌瘤手术疗效评估

胃肠胰神经内分泌瘤 在一项前瞻性 GEP-NEN 研究中，术前所有 35 名患者 (100%) 的评分均有所提高。相比之下，只有 14 人（40%）的 CgA 升高。切除使 NETest 从 80% ± 5% 降低到 29% ± 5 ( P <.0001)。NETest 减少与肿瘤体积减小相关（R 2 = 0.29；P = .03）。CgA 降低不显着，并且与肿瘤切除的程度无关。R0 切除的评估特别令人感兴趣，因为报告为完成的 11 例切除中有 4 例（36%）在 1 个月时 NETest 升高。随后，所有 4 人在手术后 6 个月内都出现了阳性肿瘤成像。

支气管肺神经内分泌肿瘤 对 21 名患者进行了一项前瞻性 BP-NEN 研究。术后 6 个月，9 人（43%）有疾病证据（残留/复发），12 人（57%）无病。在复发组中，水平从术前 (71% ± 11%) 到术后 (66% ± 8%；P =不显着) 没有变化。在无病组中，术前基因表达水平 (70% ± 7%) 通过手术显着降低至 23% ± 3% ( P = .0005)。

这些结果表明，血液 NET 转录物描绘了手术切除/细胞减灭术，并有助于早期识别 GEP-NEN 和 BP-NEN 中的残留疾病。

监测治疗效果

生长抑素类似物 在一项前瞻性、盲法研究中评估了疗效。与 CgA 相比，评估了 NETest 的效用预测治疗失败的能力。在 28 名接受 SSA（奥曲肽 [n = 14] 和兰瑞肽 [n = 14]）的患者中，单变量分析发现 NETest ( P = .002) 和肿瘤分级 ( P = .054) 与治疗反应相关。多元回归分析发现，只有 NETest 预测了 SSA 使用期间的疾病进展（P =.0002)。NETest 变化发生的时间明显早于图像变化（大约在图像定义进展前 5 个月）。它在识别进展的患者方面也是 100% 有效的。多元回归分析未确定 CgA 可预测 SSA 治疗。这项研究确定 NETest 在预测 SSA 治疗反应方面表现出效用。

因为在临床学术试验中表现出实用性的生物标志物测定并不总是有效地转化为现实世界的环境， 进行了一项美国注册研究 () 以确认该测定在一项前瞻性观察研究中的临床效用。一项针对美国 51 名接受 SSA 治疗的患者的研究发现，所有得分低（NETest ≤40%）的患者（n = 37）都能够继续治疗，而无需对治疗（类型或剂量）进行任何修改。相比之下，所有得分高（NETest ≥80%）（n = 24）的人要么接受了治疗调整（86%），要么继续使用当前的治疗方案。所有（n = 24）都表现出与对SSA无反应一致的疾病进展。在其中 21 名患者中，进行了适当的治疗调整（剂量增加、改变 SSA 类型或引入选择性内部放射治疗或 PRRT）。所有（n = 21）在随访时都表现出疾病稳定（6个月：基于图像的确认）。得分低的患者未达到中位 PFS (mPFS)。高分与 5 个月的 mPFS 相关（χ2 = 27.7；风险比 [HR] 60.2 (18–201)；P <.0001) (图 6）。

图 6:前瞻性观察登记队列中 NETest 评分与 PFS 之间的关系。( A ) 观察和等待队列：低 NETest 评分与 12 个月的 mPFS 相关，高评分与 3 个月的 mPFS 相关。这种差异是显着的（HR 30.4；P< .0001）。( B ) 治疗组：低分与 12 个月时未达到的 mPFS 相关，高分与 5 个月的 mPFS 相关；这种差异是显着的（HR 60.2；P< .0001）。

肽放射受体治疗 虽然以前被认为是一种实验性或 Hail Mary 治疗策略，但 PRRT 是一种有效且成熟的 NET 疗法。原则上，选择是基于对生长抑素受体摄取的基于图像的评估，尽管并非所有患者都有反应。为了更好地预测疗效，开发了肿瘤分级和 NETest 基因特征（包括生长因子信号传导和代谢组基因表达）的特定组学分析变体的组合作为预测商。这在 PRRT 治疗前的 3 项前瞻性研究 (n = 158) 中进行了评估。该预测器签名有 2 个输出——阳性（预测对治疗的反应）和阴性（无反应者）。使用决策曲线分析的数学评估显示出超过 90% 的标准化预测益处，最高可达 80% 的预测生物标志物分析的风险阈值。CgA 值或等级分层的益处等同于不使用生物标志物（在可比较的风险阈值中<10%）。总体而言，该生物标志物预测肿瘤对 PRRT 反应的准确率为 94% 至 97%。那些预计对 PRRT 有反应的人（治疗开始后长达 31 个月）从未达到 mPFS。对于无反应者，mPFS 为 8 个月至 14 个月。PRRT 预测性生物标志物的总 HR 为 47。

作为监测器，对所有 51 个标记基因的测量确定 NETest 与 PRRT 反应者 (97%) 与无反应者 (91%) 准确相关 (94%)。此外，在治疗期间，基因表达评分的变化准确地（89%，P <10 -6）与治疗反应评估（RECIST）相关。相比之下，CgA 的变化只有 24% 的准确率。总体而言，NETest 和预测因子分析（PRRT 预测商）确定，可以在超过 90% 的个体中准确预测和监测 PRRT 疗效。长期管理评估

回顾性队列分析 一项针对 34 名患者的长期（5 年）研究发现，NETest 对 GEP-NET 具有预测和预后效用。转录水平的血液测量在基于图像的进展证据之前大约 1 年确定了临床上可行的改变。Cox 模型确定与 PFS 相关的唯一因素是 NETest。基线 NETest 大于 80% 与疾病进展显着相关（mPFS：0.68 年 vs 2.78 年，<40% 水平）。相比之下，在定义为临床稳定的那些中，基线 NETest 水平大于 40% 是疾病进展的 100% 预后。低于 40% 的基线 NETest 值准确 (100%) 预测了 5 年的稳定性。χ 2将 NETest 值变化与 CgA 水平进行比较的分析表明，在预测疾病状态变化方面，NETest 比 CgA 提供的信息多 96%（P <.001）。前瞻性观察研究 在一项注册研究 () (n = 100) 中，低 NETest 分数与观察和等待计划中的保守管理和维护相关 (n = 28)。在随访（12 个月）时，一切都保持稳定。所有得分高（NETest ≥80%）的患者（n = 12）都需要治疗干预，并且在随访（12 个月）时疾病稳定（影像学或症状减轻）。低分与 12 个月的 mPFS 相关。高分与 3 个月的 mPFS 相关。这种差异是显着的（χ 2 = 27.7；HR 30.4 [95% CI，8.5-108]；P <.0001）。使用 McNemar 测试（评估配对样本集中的 2 个生物标志物）将 NETest 与 CgA 进行比较表明 CgA 在决策制定中没有临床价值。总体而言，较低的 NETest 分数降低了大约 40% 的成像（图 7）。

图 7:CgA 和 NETest 的比较临床效用；研究了 100 名患者，其中 53 名同时进行了 NETest 和 CgA。NETest 在所有 53 个样本中均为阳性。13 人（25%）的 CgA 水平升高，40 人（75%）正常。53 名患者中有 18 名 (34%) 的 NETest 得分较高。78% 的患者改变了临床管理（干预）。在随后的随访（12 个月）中，所有患者都表现出疾病稳定。低分与 1 名患者 (4%) 的管理变化有关。该患者服用依维莫司后病情进展。所有其他患者（96%）表现出疾病稳定。CgA 与大约 30% 的患者的临床管理改变有关，无论 CgA 水平是否升高。根据干预和评分，疾病稳定在 6% 到 62% 之间。因此，CgA 水平， 与高分相比，P< .0001。F/Up，跟进；莫，月；1ve，阳性。

未来

一个最佳的生物标志物需要具备 3 种能力，即诊断、预测和预后。因此，可以及早发现疾病、预测治疗效果并监测疾病状态。液体活检符合实时疾病管理的标准，并避免了组织活检的负面侵入性影响和单时间点限制。此外，它提供的信息对成像具有辅助价值，但更容易重复，并且没有任何与辐射相关的问题。最近很明显，一个关键要求是开发一种液体活检，它可以更好地识别特定 NEN 中的适当药物靶标，然后确定治疗反应。这很关键，因为许多治疗策略的疗效有限，表现出显着的不良事件，并且价格昂贵。在这方面，PRRT 预测特征证明了循环 RNA 作为生物标志物的效用(图 8）。特征捕获的生长因子和代谢组基因都与氧化应激、代谢和缺氧信号特别相关。鉴于缺氧、氧化应激和与辐射响应性相关的 DNA 修复丧失的作用，血液中这些基因的表达升高很可能识别出对辐射更敏感的肿瘤。因此，PRRT 疗效预测的特异性反映了与放射反应相关基因相关的分子机制的确定，这些基因调节肿瘤对 PRRT 的反应。

图 8:肿瘤细胞对177 Lu-octreotate 治疗的反应动画。对 PRRT 有反应的肿瘤（蓝色）表现出循环基因指纹，该指纹具有完整的、受调节的生长因子信号通路和正常的代谢通路。预计这些肿瘤会经历显着的 DNA 损伤和肿瘤细胞凋亡，从而导致消退或疾病稳定。自主生长因子调节并表现出异常代谢组（高度代谢活跃）的肿瘤（橙色）对 PRRT 有不同的反应。大多数（85%–100%）具有预测无应答基因特征的肿瘤在 PRRT 后确定临床进展。在 PRRT 之前评估血液 NET 基因表达有助于精确识别 PRRT 反应性肿瘤。(修改自Kidd M，Modlin IM。治疗：液体活检在管理和预测 NET 的 PRRT 中的作用。Nat Rev Gastroenterol Hepatol 2017；14：6：331–2；经许可。）

鉴于最近证明 PRRT 的功效，预测策略具有特殊意义。尽管 PRRT 的耐受性非常好，但有证据表明对肾脏和骨髓有适度的毒性。这些在很大程度上是不可预测的，因为它们的发病机制知之甚少，在某些情况下，显然是特殊的。无论病因如何，预测或准确评估此类事件风险的需求至关重要。因此，基于血液的基因表达测量提供了识别与肾单位或骨髓毒性相关的转录本的机会。这种测试的开发将为当前的 PRRT 预测商提供补充，并为特定患者提供风险收益比的分子评估。

结尾

NETest 已在超过 5500 名 NEN 患者中进行了评估，并确定在几个不同领域表现出临床实用性。这些包括评估治愈性手术的有效性、评估 SSA 治疗的有效性、预测疾病的稳定性/进展以及确定对 PRRT 的反应。该特征因手术而降低，并且值对应于肿瘤切除的完整性。此外，R0 切除后升高的水平准确地预测了随后的疾病复发。在另一项研究中，转录水平升高预示着 SSA 失败/疾病进展。转录水平的改变明显早于基于 RECIST 或基于生长抑素受体成像的疾病进展测量。最后，水平是 PRRT 疗效的预后指标，可用于评估治疗效果并与基于图像的评估相关。目前的数据确定了转录分析在监测各种治疗方式中的价值，特别是结合其他临床和成像参数来监测疾病进展。作者预测，未来改进和改进治疗评估的策略将通过结合成像方式和肿瘤转录组分析提供的基于血液的分子信息来提供。

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关键点

• NETest 是一种血液生物标志物测试，用于诊断和管理胃肠胰和支气管肺神经内分泌肿瘤。
• 该测试测量 1 mL 血液中的 51 个个体循环基因，算法分析提供疾病状态的数字评分。
• 该试验的敏感性和特异性分别>95%和>90%。
• 在头对头比较中，该测试比 CgA 精确约 4 倍，而对于监测疾病进展，它更精确约 10 倍。
• 在临床上，该测试可以确定手术切除的完整性，识别残留疾病，监测疾病进展并确定治疗效果。
• 使用预测商基因集和 Ki67 (PPQ) 可以准确 (~95%) 预测 PRRT 功效。
• 神经内分泌疾病状态（稳定/进展）可以通过定期监测血液 NETest 水平来评估。

Review 

Endocrinol Metab Clin North Am

. 2018 Sep;47(3):485-504. doi: 10.1016/j.ecl.2018.05.002.

The NETest: The Clinical Utility of Multigene Blood Analysis in the Diagnosis and Management of Neuroendocrine Tumors