【佳学基因检测】循环肿瘤DNA基因检测（ctDNA)的临床应用

肿瘤基因检测导读：

循环肿瘤DNA(ctDNA)，源自肿瘤细胞，反映了肿瘤发展过程中的一系列变化，如基因突变、DNA甲基化、重排、微卫星不稳定性（MSI）、LOH等。它可以作为肿瘤诊断与治疗的重要有利标志物，在早期肿瘤筛查、早期诊断、预后监测、肿瘤分子亚型和临床药物选择方面起到关键作用。肿瘤基因解码基因检测的研究结果显示，在非小细胞肺癌和结直肠癌中使用循环肿瘤DNA(ctDNA)的原因可能是这两种癌症的驱动基因已比其他癌症类型更深入地研究。

对于循环肿瘤DNA(ctDNA)的管理，包括提取、检测、分析和应用四个方面。在提取方面，目前循环肿瘤DNA(ctDNA)来自肿瘤细胞凋亡，其实际来源不仅仅是最常见的外周血液，还有尿液、粪便、腹水和脑脊液等。不同来源的循环肿瘤DNA(ctDNA)需要不同的预处理方法和最终提取方法。最常用的试剂盒是Qiagen的QIAamp循环核酸提取试剂盒。检测是循环肿瘤DNA(ctDNA)管理中最重要的部分。到目前为止，肿瘤基因解码基因检测人员已经开发了许多用于检测循环肿瘤DNA(ctDNA)中最常见的突变和甲基化变化的方法，其中大多数依赖于测序方法。然而，由于循环肿瘤DNA(ctDNA)含量极低，突变和甲基化比例也很低，只能使用深度测序，这导致测序成本大幅增加。此外，许多研究人员还从酶和材料科学的角度开发了其他检测方法。虽然在确保高灵敏度和高特异性的同时，检测过程在一定程度上比较复杂，还需要进一步优化以生成用于临床检测的产品。自2019年新冠病毒全球爆发以来，已经开发了一系列病毒检测方法，例如CRISPR-Cas系统与等温扩增（包括RPA、LAMP、RCA和RAA）的结合。同样，对于循环肿瘤DNA(ctDNA)的检测方法也在不断更新。此外，随着材料科学、光学等学科的快速发展，SPR、微流控技术、表面共振技术和石墨烯吸附理论也可以应用于循环肿瘤DNA(ctDNA)的检测。这是否能够引发新一代循环肿瘤DNA(ctDNA)检测技术的发展？目前，许多体外诊断公司推出了一些循环肿瘤DNA(ctDNA)检测试剂盒，但其检测限一般为0.1%。需要进一步优化检测以应用于更低水平的循环肿瘤DNA(ctDNA)，以指导其在肿瘤管理中的后续应用。数据分析通常与检测技术相匹配。最后，关于循环肿瘤DNA(ctDNA)检测的应用，最常见的应用是在结直肠癌和非小细胞肺癌中，涉及早期诊断、预后监测、复发监测和指导抗药性治疗。然而，对于其他实体肿瘤，如肝癌、胃癌和乳腺癌，循环肿瘤DNA(ctDNA)检测仍处于停滞阶段，因此有很大的发展空间。此外，还有一些实际和重大问题需要考虑，包括：a）循环肿瘤DNA(ctDNA)与肿瘤脱离较少，其在cfDNA中的比例较低；b）循环肿瘤DNA(ctDNA)很少能够重现肿瘤的异质性；c）循环肿瘤DNA(ctDNA)中的突变不特异于特定的癌症，也在其他癌症类型中高度突变。例如，PIK3CA E545K/E542K是乳腺癌中第二常见的PIK3CA突变，但它在结肠腺癌、肺腺癌和膀胱尿路上皮癌中也高度突变。没有什么是完美的。将循环肿瘤DNA(ctDNA)与其他特异性肿瘤标志物和检测方法结合起来可能是一个出乎意料的选择。

循环肿瘤DNA(ctDNA)是反映肿瘤基因水平变化的理想肿瘤标志物。一旦循环肿瘤DNA(ctDNA)的奥秘被揭开，研究人员可以设计相应的靶向抑制剂，临床医生可以治疗癌症源头，监测实时疗效，并评估患者的预后情况。

循环肿瘤DNA（ctDNA)与肿瘤早期诊断

众所周知，癌症是多基因突变的结果，严重威胁患者的健康。早期的检测和诊断是目前肿瘤治疗成功的主要因素，能够有效提高患者的生活质量。目前，肿瘤的早期诊断主要依赖基因检测，而病理性肿瘤释放到血液中的循环肿瘤DNA(ctDNA)具有独特的优势。比较了液体活检在肿瘤早期诊断中多种分子（如循环肿瘤DNA(ctDNA)、cfDNA、CTC和多个生物标志物）的特异性和敏感性。令人意外的是，cfDNA和循环肿瘤DNA(ctDNA)的检测效率优于其他参数。肿瘤风险基因检测构建了一个诊断评分（cd-score），其中包括结直肠癌患者循环肿瘤DNA(ctDNA)中的九个甲基化标记物。cd-score对结直肠癌的诊断具有出色的敏感性和特异性，优于常规结直肠癌诊断标志物CEA（AUC：0.96 vs. 0.67）。此外，cd-score还在结直肠癌肿瘤分期、治疗方法和治疗后微小残留病变的判断方面发挥作用。此外，在涉及16,890名参与者的前瞻性研究中，甲基化标记物cg10673833被选择并确定为高危结直肠癌患者的早期诊断标记物，具有高特异性（86.8%）和敏感性（89.7%）。肿瘤的早期诊断基因检测在与中国23个医疗中心合作的研究中，从10,560名患者中提取了循环肿瘤DNA(ctDNA)进行下一代测序，观察到肺部结节可根据患者循环肿瘤DNA(ctDNA)的甲基化进行诊断。KRAS是胰腺癌中最常见的突变基因，最常见的突变位点是c.35>A，p.G12D和c.38G>A，p.G13D。研究发现，循环肿瘤DNA(ctDNA)中的KRAS突变等位基因比例（MAF）在胰腺癌的诊断中起着重要作用。将KRAS MAF与常规生物标志物CA19-9结合可以显著提高检测灵敏度，达到82%。此外，在同一患者中，循环肿瘤DNA(ctDNA)中的KRAS MAF与病变组织中的一致性一致。此外，循环肿瘤DNA(ctDNA)还可以与超声弹性成像相结合，增强对乳腺癌病变硬度变化的评估，实现乳腺癌的早期诊断和预后评估。

此外，肿瘤风险基因分析描述了一种名为CancerSEEK的血液检测方法，可用于卵巢、肝脏、胃、胰腺、食管、结肠直肠、肺或乳腺癌的检测。该检测包含了16个常见突变基因（如PIK3CA、APC、EGFR、TP53和KRAS）的61个突变位点和41个肿瘤特异性蛋白标志物（如AFP、CA-125、sHER2/sEGFR2/sErbB2等）。突变主要用于分析是否存在癌症以提高检测敏感性，而肿瘤特异性蛋白标志物可以用于癌症类型，提高检测的特异性（>99%）。在1005名上述八种癌症患者中，该方法的中位阳性率为70%，假阳性率较低（7/812）。然而，由于该检测方法只与正常健康人群进行比较，当该方法应用于亚健康人群时，阳性率是否会增加？如何解决这个实际问题需要研究人员进一步研究。类似地，肿瘤的临床应用基因检测将血液检测与全身诊断正电子发射断层扫描-计算机断层扫描（PET-CT）相结合，命名为DETECT-A（通过自愿基于突变的血液收集和检测来更早地检测癌症）。血液检测还可检测肿瘤特异性突变，然后通过PET-CT进行重新诊断、定位和精确治疗以改善治疗效果。通过血液检测从9911名志愿者中筛选出134名受试者。在134名阳性患者中，64名通过PET-CT显示与肿瘤相关的成像信息，然后通过活检技术进行确认，26名患者患有癌症，并随后接受相应的临床治疗。尽管该方法复杂，但DETECT-A具有准确性，并减少了过度诊断和过度治疗决策，可以纳入例行临床护理中。对于早期肿瘤筛查，甲基化可以作为独立的预测因子。肿瘤的分子诊断基因检测开发了一种循环肿瘤DNA(ctDNA)甲基化检测方案，称为PanSeer，通过筛选来自一些众所周知的与肿瘤相关的基因的477个肿瘤特异性、10613个CpG位点，并使用全基因组亚硫酸盐测序（WGBS）对血液样本进行测序。该方法用于对太州纵向研究中的健康受试者进行了为期四年的测试，其中605名无症状个体中有191人被诊断为胃癌、食管癌、结直肠癌、肺癌和肝癌。PanSeer检测通过针对在不同癌症类型中常见的异常甲基化的有限基因组区域，检测癌症，但可能无法预测未来会发生癌症的患者。PanSeer最有可能尽早识别患有癌症生长但无法通过当前检测方法检测到的无症状患者。在最大的临床基因组计划中，cfDNA中的甲基化检测仍显示出出色的肿瘤早期筛查性能，能够成功检测到50多种不同阶段的癌症，具有99.3%的特异性。鼻咽癌（NPC）是一种具有独特地理特征的癌症，在中国的东南部和南部高发，癌症的发生和发展与Epstein-Barr病毒（EBV）感染密切相关，几乎每个癌细胞都含有EBV基因组。因此，通常认为循环肿瘤EBV DNA（ctEBV DNA）可以作为NPC的独特生物标志物。肿瘤的超早期基因检测通过靶向捕获测序对20,174名无症状个体进行了NPC筛查。结果显示，与非NPC受试者相比，NPC患者的血浆ctEBV DNA含量增加，片段长度明显延长，表明ctEBV DNA的检测为NPC筛查提供了有利工具。此外，ctEBV DNA在NPC的预后、风险分层和复发监测中也发挥着重要的临床作用。
 

循环肿瘤DNA（ctDNA）基因检测与肿瘤预后

循环肿瘤DNA(ctDNA)是一个出色的肿瘤预后标志物。在FIRSTANA和PROSELICA两项前瞻性三期临床试验中，通过低通量全基因组测序对循环肿瘤DNA(ctDNA)进行了测序。单因素分析和分层多因素分析显示，循环肿瘤DNA(ctDNA)评分与前列腺癌的整体预后相关。肿瘤靶向药物治疗效果基因检测利用ULP-WGS检测到了24例乳腺癌脑转移阳性患者中的高水平循环肿瘤DNA(ctDNA)，但未检测到任何阴性循环肿瘤DNA(ctDNA)的患者。此外，循环肿瘤DNA(ctDNA)的诊断效果远远优于目前的金标准，即脑脊液细胞学和常规诊断方法MRI。此外，随着患者接受硬膜外治疗，循环肿瘤DNA(ctDNA)含量的降低与其延长生存期相关。在患者的脑脊液中连续检测循环肿瘤DNA(ctDNA)可以预测硬膜外治疗后疾病进展。对于转移性膀胱癌患者，循环肿瘤DNA(ctDNA)中FGFR3基因的变异与对厄达替尼的增加敏感性和患者的延长无进展生存相关。通过实时定量甲基化PCR筛选BRCA1、SLFN11和USP44甲基化标记物，对高级别浆液性卵巢癌患者的癌组织和外周血进行了检测。患有晚期癌症患者的循环肿瘤DNA(ctDNA)中SLFN44的甲基化水平与无进展生存差相关。一项涉及672名卵巢癌患者的荟萃分析显示，循环肿瘤DNA(ctDNA)与肿瘤大小和分期有关。此外，较高水平的循环肿瘤DNA(ctDNA)与不良预后相关。因此，循环肿瘤DNA(ctDNA)可以被视为卵巢癌患者潜在的分子预后指标。分子肿瘤负担指数（mTBI）是与肿瘤进展相关的术语。与乳腺癌初始肿瘤评估中mTBI > 0.02%的患者相比，mTBI < 0.02%的乳腺癌患者具有更好的无进展生存和总体生存。循环肿瘤DNA(ctDNA)中的mTBI水平在临床观察或成像检测到肿瘤体积减小之前呈显著下降趋势，表明mTBI可以作为乳腺癌的有效预后标志物，有助于识别治疗效果良好的患者并进一步优化其靶向治疗。除了实体肿瘤外，循环肿瘤DNA(ctDNA)在神经内分泌肿瘤中仍然发挥着重要作用。在神经内分泌肿瘤中，循环肿瘤DNA(ctDNA)的存在与原发肿瘤的分级和位置相关。与循环肿瘤DNA(ctDNA)阴性患者相比，循环肿瘤DNA(ctDNA)阳性患者的总生存期较短，死亡风险较高，有助于预测肿瘤的进展。循环肿瘤DNA(ctDNA)是否可以用于神经内分泌肿瘤的靶向药物选择和治疗效果检测？这是一个值得进一步探索的问题，具有极其有意义和创新的方向。以血浆循环肿瘤DNA(ctDNA)中的肿瘤分数（TF）作为指标，在1725名癌症患者（198例转移性去势抵抗性前列腺癌，223例转移性结直肠癌，902例非小细胞肺癌和402例乳腺癌）中进行了单因素/多因素分析。结果显示，患者的整体生存期与TF > 10%独立且一致相关，使得癌症治疗的分级准确，减少了过度治疗的可能性。肿瘤基因检测的临床应用研究从11878个CpG位点中选择了191个有意义的甲基化单体标记物，并在晚期腺瘤和结直肠癌训练集中构建了算法。在盲验证集中，晚期腺瘤和结直肠癌的AUC分别为0.903和0.937。与低甲基化水平患者相比，术前甲基化水平高的患者预后较差。

循环肿瘤DNA（ctDNA）基因检测与肿瘤分子亚型的确定

癌症通常是涉及多个基因的复杂疾病。不同阶段具有不同的基因表达谱。癌症的遗传性、个体差异性和分子机制的复杂性各异。此外，根据其分子特征，癌症可以分为不同的亚型。最常见的是基于人表皮生长因子受体（HER）致癌基因的分子亚型划分。基于Ki-67标记指数用于检测细胞增殖和分析雌激素（E）和孕激素受体（PgR）的状态，乳腺癌分为基底样、卵泡样A型和卵泡样B型亚型。迫切需要针对不同癌症亚型的准确治疗策略，包括准确的诊断、预后分层、肿瘤分期、复发监测和药物研发。这些步骤可以提高治疗效果，挽救癌症患者的生命，并改善他们的生活质量。最近发现循环肿瘤DNA(ctDNA)在癌症的分子亚型划分中也发挥作用。肿瘤分子诊断基因检测从5000多名中国肺癌患者中提取了循环肿瘤DNA(ctDNA)，并发现不论肺癌是腺癌、鳞癌、腺鳞癌还是大细胞肺癌，非小细胞肺癌患者的循环肿瘤DNA(ctDNA)和bTMB水平均显著低于小细胞肺癌患者（p < 0.001）。近期的研究报道了小细胞肺癌的亚型包含atonal bHLH转录因子1（ATOH1）、pOU类2 homeobox 3（POU2F3）、神经分化因子1（NEUROD1）和achaete-scute类同源基因（ASCL1）。此外，根据对177个SCLC临床样本的分析，NEUROD1、ASCL1HE和双阴性亚型是主要的亚型。在这项研究中，利用肿瘤的精准诊断基因检测的研究中59个细胞系的甲基化测序数据筛选出了366个差异甲基化区域（DMR），通过高效的DMR，在56个SCLC临床血样本中成功区分了三个主要的SCLC亚型，分别占73%、13%和14%，并通过免疫组化结果进行了验证。对于绝大多数原发性转移性去势敏感型前列腺癌（mCSPC）患者来说，仅通过肿瘤组织和cfDNA测序无法提供关于患者的体细胞信息。循环肿瘤DNA(ctDNA)和组织的联合应用揭示了mCSPC患者的基因水平变化，如广泛的TP53突变和MSH2截短突变。因此，这是一种评估肿瘤分子亚型的有利方法，为癌症患者的下一步靶向治疗策略的开发打下坚实基础。此外，肿瘤基于分子机理的先进诊断检测优化了一种基于WGBS的循环肿瘤DNA(ctDNA)甲基化检测方法，并确定了15个甲基化生物标志物（DMR），可显著区分早期和晚期乳腺癌患者与健康志愿者（AUC: 0.996）。此外，鉴定了12个循环肿瘤DNA(ctDNA) DMRs作为区分乳腺癌临床亚型的潜在生物标志物，在38例乳腺癌患者的训练集和123例患者的验证集中得到了验证。这12个生物标志物可以有效区分ER（+）和ER（-）乳腺癌患者（AUC值分别为0.984和0.780，灵敏度分别为93%和73%，特异度分别为93%和87%）。该方法也适用于肝细胞癌和肺癌，并能有效区分它们的分子亚型。总之，循环肿瘤DNA(ctDNA)也可以揭示与肿瘤分型相关的分子标志物，为肿瘤分型做出贡献。

循环肿瘤DNA（ctDNA）基因检测与肿瘤的复发监测

循环肿瘤DNA(ctDNA)在肿瘤复发监测中起着重要作用。例如，术后检测到胃癌患者的循环肿瘤DNA(ctDNA)突变，其中6名患者出现癌症复发并死于癌症转移引起的并发症。相反，11名无循环肿瘤DNA(ctDNA)突变的患者在手术后没有复发并且生活质量良好，这表明循环肿瘤DNA(ctDNA)有潜力成为胃癌患者术后预后和复发监测的检测参数。肿瘤的复发监测基因检测构建了长期循环肿瘤DNA(ctDNA)分析和时间至复发的联合模型。与传统的Cox方法相比，联合模型对非小细胞肺癌的复发具有更好的预测潜力。随着随访时间的延长，患者P062的循环肿瘤DNA(ctDNA)水平保持不变，复发率较低，病情稳定。相反，患者P017的循环肿瘤DNA(ctDNA)水平逐渐增加，模型预测复发风险显著增加，最后一次随访后不久就发生了复发，这表明该模型能够实现对非小细胞肺癌患者循环肿瘤DNA(ctDNA)水平的动态监测和复发风险的预测。根据预测结果，提前使用新辅助化疗改善患者的预后。在肝细胞癌切除术后，循环肿瘤DNA(ctDNA)的阳性率显著降低。与未达到重大病理学反应（MPR）或完全病理学切除的患者相比，MPR患者的循环肿瘤DNA(ctDNA)含量较低。新辅助治疗后，MPR患者的循环肿瘤DNA(ctDNA)阳性率从33.3%增加到83.3%，而非MPR患者的循环肿瘤DNA(ctDNA)也呈上升趋势。在几个已确诊患者中，准确验证了循环肿瘤DNA(ctDNA)的上升趋势与癌症复发的相关性，表明循环肿瘤DNA(ctDNA)可能在评估临床病理学反应和肿瘤复发中发挥作用。尽管先前的研究发现，癌症患者的血液循环肿瘤DNA(ctDNA)变化与疾病进展有关，但仍需要对患者的病变组织进行测序，将循环肿瘤DNA(ctDNA)突变与肿瘤原始突变对齐，以确保检测的有效性。然而，对于一些患者来说，获取组织样本并不容易，由于肿瘤的异质性，外科医生获取的组织样本中的突变类型可能与循环肿瘤DNA(ctDNA)中的突变类型有很大不同。正如肿瘤的复发监测所展示的，结合循环肿瘤DNA(ctDNA)基因组学和表观遗传学在结直肠癌患者中的应用可以利用仅使用血浆样本评估患者的复发和预后，并实现纵向疾病监测。全新辅助治疗对于局部晚期直肠癌患者是一种有效的治疗方法。在GEMCAD 1402多中心临床试验中，肿瘤的复发监测基因检测对180名直肠癌患者进行了术前和术后的定期随访。结果显示，术前的循环肿瘤DNA(ctDNA)水平可以预测患者对全新辅助治疗的反应以及复发和生存情况。此外，术前循环肿瘤DNA(ctDNA)阳性的9名患者出现疾病转移，其中7名患者出现单器官转移，2名患者出现多器官转移。术前循环肿瘤DNA(ctDNA)对肝转移的敏感性和特异性较高（分别为75%和90%）。然而，在肺和腹膜复发的患者中术前检测循环肿瘤DNA(ctDNA)较困难，这表明循环肿瘤DNA(ctDNA)与患者的复发部位有关。这个结论需要在更大的临床样本中进一步验证。在结直肠癌中，循环肿瘤DNA(ctDNA)阳性表示肿瘤复发的效果明显。共有125名患者在手术前接受了循环肿瘤DNA(ctDNA)检测，其中122名患者的循环肿瘤DNA(ctDNA)为阳性。手术后，16名复发患者中有14名的循环肿瘤DNA(ctDNA)为阳性。接受手术后30天，循环肿瘤DNA(ctDNA)阳性患者的复发率显著高于循环肿瘤DNA(ctDNA)阴性患者。不仅手术切除表现出这种现象，接受新辅助化疗的患者也是如此。所有7名循环肿瘤DNA(ctDNA)阳性的患者在新辅助化疗后复发。体内残留少量肿瘤细胞称为极低残余病（MRD）。在肿瘤的复发监测的论文中，基于循环肿瘤DNA(ctDNA)的MRD与转移性结直肠癌患者的无病生存显著负相关（p < 0.001），表明它可以成为转移性结直肠癌的预后因素。此外，循环肿瘤DNA(ctDNA)结合生物标志物CEA也具有良好的预后效果。此外，循环肿瘤DNA(ctDNA)在MRD和预测黑色素瘤、肺癌、局部结直肠癌、胰腺导管腺癌等癌症的复发中的作用逐渐得到确认。
 

循环肿瘤DNA（ctDNA）基因检测与临床用药指导

药物治疗，无论是化疗还是免疫疗法，都是个体化选择。在经过一段时间的药物治疗后，一些患者会产生耐药性。通过循环肿瘤DNA(ctDNA)检测，患者可以接受个体化的药物治疗，选择更有利的药物进行治疗。对于III期结直肠癌患者，辅助化疗的治疗效果明显，但对于手术治疗效果不佳的II期癌症患者，辅助化疗的临床益处尚不清楚。一项名为DYNAMIC的随机试验旨在评估以循环肿瘤DNA(ctDNA)为指导的方法是否能在不影响复发风险的情况下减少辅助治疗的使用频率。该试验包括302名接受循环肿瘤DNA(ctDNA)指导管理的患者和153名接受标准管理的患者，结果显示与标准管理相比，循环肿瘤DNA(ctDNA)检测可以减少II期结直肠癌患者的辅助治疗使用，并不损害无复发生存率。因此，循环肿瘤DNA(ctDNA)检测可以预测II期结直肠癌患者是否能从辅助化疗中受益，从而减少患者的心理和生理损伤以及不必要的医疗费用。在评估接受CDK4/6抑制剂治疗的HR+/HER2+晚期乳腺癌（ABC）患者的总生存率的探索性分析中，PALOMA-3试验发现，在循环肿瘤DNA(ctDNA)中没有TP53/PIK3CA/ESR2突变的患者在接受帕博西尼加富勒韦的治疗时表现出更好的总生存率和无进展生存期，表明循环肿瘤DNA(ctDNA)中的驱动基因突变可以为临床医疗管理提供预测价值。肿瘤精准用药基因检测构建了基于循环肿瘤DNA(ctDNA)测序的肿瘤突变（TMI）模型，结合循环肿瘤DNA(ctDNA)中的血肿瘤突变负荷（bTMB）。敏感性血肿瘤突变负荷（sbTMB）和易感性评分（UMS）被用来评估非小细胞肺癌患者是否能从抗血管生成抑制剂安罗替尼、化疗药物多西他赛或免疫检查点抑制剂阿特伊珠单抗中获益。该模型包括许多影响因素，如：（a）多级基因突变，（b）临床特征（包括病理类型、驱动基因状态、转移数量、性别和吸烟史）和（c）通过TMI和bTMB在化学免疫治疗或免疫治疗之间的临床效果比较。此外，TMI能够有效预测非小细胞肺癌患者对多西他赛或阿特伊珠单抗的反应，可被认为是一种理想的生物标志物。此外，接受阿特伊珠单抗治疗的低TMI患者通常显示出改善的总生存率。根据精确治疗的原则，准确的药物选择可以减少医疗资源的浪费，避免对患者进行无效治疗的可能性。由循环肿瘤DNA(ctDNA)得出的TMI可以实现这一目标，并且该方法并不仅局限于非小细胞肺癌。在各种癌症中建立相应的TMI模型是通用的。在用抗EGFR单克隆抗体治疗RAS野生型转移性结直肠癌患者时，经过一段时间的治疗后出现RAS、BRAF和EGFR基因等的耐药突变将大大降低患者的治疗效果，而这些突变可以在患者的外周血中检测到。因此，一项名为CHRONOS的开放标签、单臂II期临床试验首次提出在接受EGFR单克隆抗体帕尼单抗治疗的患者中检测耐药突变，以指导精确的临床用药，以避免毒副反应和无效治疗。在52名患者中的帕尼单抗治疗过程中，使用ddPCR监测由KRAS、BRAF和EGFR细胞外区域（ECD）组成的循环肿瘤DNA(ctDNA)突变面板。16名治疗效果不佳的患者中至少有一个耐药突变，提示耐药突变的出现与帕尼单抗的失败有关。根据作者提出的“零突变循环肿瘤DNA(ctDNA)筛查”原则，36名没有循环肿瘤DNA(ctDNA)突变的患者在试验中继续接受帕尼单抗治疗。循环肿瘤DNA(ctDNA)的检测可以预测患者的治疗反应，并且循环肿瘤DNA(ctDNA)提供的治疗时间比事先提供的更个性化和准确。简而言之，在CHRONOS试验中，通过检测循环肿瘤DNA(ctDNA)突变，可以最大化帕尼单抗治疗转移性结直肠癌患者的治疗效果，避免了不良反应，并为具有循环肿瘤DNA(ctDNA)突变的患者提供更准确的治疗策略。

在评估是否血肿瘤突变负荷（bTMB）可以成为肺腺癌局部晚期或转移性III期B-IVB患者的免疫疗法新生物标志物的II期B-F1RST试验中，意图治疗患者的客观缓解率会随bTMB的阈值值的变化而改变。最终，该试验报告显示bTMB与较长的总生存期呈正相关，表明bTMB可以成为患者免疫疗法的另一个预测性生物标志物。