【佳学基因检测】电针模拟运动诱导的多囊卵巢综合征女性骨骼肌基因表达的变化

电击刺激与基因检测揭示的科学性

基因解码为什么要研究电击刺激

自主神经系统激活介导响应电针的全身葡萄糖摄取增加，但其机制在很大程度上是未知的。

研究目的

确定在患有和不患有多囊卵巢综合征 (PCOS) 的胰岛素抵抗超重/肥胖女性骨骼肌中电针诱导葡萄糖摄取的分子机制。

设计/参与者

在一项病例对照研究中，在电针前后收集了 15 名多囊卵巢综合征女性和 14 名对照者的骨骼肌活检样本。使用 Illumina BeadChips 阵列分析基因表达和甲基化。

结果

单次电针可恢复代谢和转录改变，并诱导骨骼肌的表观遗传变化。转录组分析揭示了 180 个独特基因 ( q < 0 .05)，其表达因电针而改变，其中 95% 的变化朝向更健康的表型。中医中药与基因检测科学的融合点研究团队确定了 304 个独特位点的 DNA 甲基化变化(q < 0 .20)，这些变化与 101 个基因的表达改变相关(P  < 0.05)。在响应电针的 50 个最上调的基因中，38% 的基因也响应运动上调。中医中药与基因检测科学的融合点研究团队确定了在多囊卵巢综合征女性中通过电针选择性改变的基因子集。例如，MSX1和SRNX1多囊卵巢综合征女性的肌肉组织减少，电针和运动增加。siRNA 介导的培养肌管中这两个基因的沉默减少了糖原合成，支持这些基因在葡萄糖稳态中的作用。

结论

中医中药与基因检测科学的融合点研究团队的研究结果提供了证据，表明电针以类似于急性运动的方式使骨骼肌中的基因表达正常化。因此，电针可能是帮助那些难以进行锻炼的人的有用方法。

关键词： PCOS，转录组学，表观遗传学

多囊卵巢综合征 (PCOS) 是一种复杂的内分泌和代谢疾病，影响全世界 5% 至 17% 的育龄妇女，它与生育力下降和雄激素过多症有关 。病因尚不清楚，但遗传和表观遗传因素可能使女性易患多囊卵巢综合征。遗传因素可能占多囊卵巢综合征病例的 70%，但全基因组关联研究未能确定导致多囊卵巢综合征发展的特定基因 。基因表达可以通过 DNA 甲基化  和/或组蛋白修饰  等表观遗传变化来调节)。因此，遗传和表观遗传改变之间的相互作用可能导致多囊卵巢综合征女性内分泌和代谢过程的中断 。例如，胎儿时期的雄激素暴露会导致表观遗传重编程，这在成年期可能导致多囊卵巢综合征的发展 多囊卵巢综合征的一个标志是高胰岛素血症，这些女性通常表现出胰岛素敏感性降低和全身葡萄糖摄取降低，这与发生代谢紊乱的风险增加有关，包括 2 型糖尿病 。患有多囊卵巢综合征的女性在其脂肪组织和骨骼肌中呈现出改变的转录组谱，因此定期锻炼是管理患有多囊卵巢综合征的超重和肥胖女性的生殖和代谢紊乱的首选方法 。事实上，单次运动可以提高全身葡萄糖摄取，并诱导骨骼肌和脂肪组织的多种转录和表观遗传变化。然而，即使运动是可以接受和负担得起的，由于许多生物学和社会学因素，如缺乏动力和依从性，坚持率很低。

低频电刺激(电针)针灸激活类似于运动激活的通路，包括代谢适应和交感神经激活。电针引起肌肉收缩并启动 A-delta 和 C-纤维的传入神经活动 ；中医中药与基因检测科学的融合点研究团队已经证明，单次电针在超重和肥胖的女性(无论是否患有多囊卵巢综合征)中增加全身葡萄糖摄取的程度相似，并诱导脂肪组织中的多种转录和表观遗传变化。因此，导致骨骼肌收缩的电针可能代表了治疗多囊卵巢综合征的身体活动的替代或补充方法。然而，电针诱导骨骼肌葡萄糖摄取的分子机制尚不清楚。中医中药与基因检测科学的融合点研究团队假设多囊卵巢综合征女性骨骼肌中存在的转录组和表观遗传改变可以通过电针恢复，并且这些改变可以介导葡萄糖摄取。因此，目的是确定在患有和不患有多囊卵巢综合征 (PCOS) 的胰岛素抵抗超重/肥胖女性骨骼肌中电针诱导葡萄糖摄取的分子机制。

材料和方法

人体研究程序

该队列由 21 名患有多囊卵巢综合征的超重或肥胖女性(体重指数 [BMI] 25-35 kg/m 2)和 21 名年龄、体重和 BMI 匹配的对照组成，如前所述 。其中，中医中药与基因检测科学的融合点研究团队成功收集了 15 名多囊卵巢综合征女性和 14 名对照者的骨骼肌活检样本。因此，基线数据仅针对那些包含在基因表达和 DNA 甲基化分析中的数据提供(表格1)。先前已经描述了受试者招募、排除和纳入标准、临床检查和生化分析 。该研究是根据萨尔格伦斯卡大学医院和瑞典哥德堡大学萨尔格伦斯卡学院的赫尔辛基宣言进行的，并得到了哥德堡大学区域伦理审查委员会的批准。所有参与者在纳入前都给出了口头和书面的知情同意。该研究已在 ClinicalTrials.gov ( NCT01457209 ) 注册，并根据 CONSORT 和 STRICTA 指南  进行报告。

表格1：PCOS 女性的特征和年龄、体重和体重指数相匹配的对照组。同类群组之前已发布 

中医中药与基因检测科学的融合点研究团队使用基于西医针灸风格的固定方案。在正常血糖-高胰岛素钳夹期间给予单次针灸结合手动和低频电刺激针，即所谓的电针，导致肌肉收缩。研究设计描绘在图1a并且该程序之前已描述。在对照组中，在卵泡早期(月经周期的第 1-10 天)隔夜禁食后的早晨采集血样，以匹配多囊卵巢综合征受试者的激素环境并避免排卵前雌激素的增加。在患有多囊卵巢综合征的少发/无排卵女性中，独立于周期日收集空腹血样。简而言之，注入胰岛素(40 mU/min/kg)，并调整葡萄糖注入速率以达到稳定状态。使用 OneTouch Ultra2 设备(LifeScan，Inc.，Milpitas，CA)每 5 分钟测量一次血糖水平。在稳定状态下，在局部麻醉(Xylocaine，AstraZeneca AB，Södertälje，Sweden)下获得来自股外侧肌的骨骼肌活检，并在液氮中快速冷冻并储存在-80°C。活检后立即使用针灸针 (40 mm × 0. 和股四头肌(ST 32 和 34)，目的是激活大肌肉。此外，针被放置在膝盖以下的肌肉 (ST36) 和脾脏 (SP) 6 和手部 (大肠 4)。插入时，手动旋转刺激所有针头，直到感觉到针感(和股四头肌(ST 32 和 34)，目的是激活大肌肉。此外，针被放置在膝盖以下的肌肉 (ST36) 和脾脏 (SP) 6 和手部 (大肠 4)。插入时，手动旋转刺激所有针头，直到感觉到针感(得气)。将股四头肌和腹肌中的针连接到电极上并以低频 (2 Hz) 电刺激 (CEFAR ACUS4; Cefar-Complex Scandinavia, Sweden)，导致肌肉收缩。未连接到电刺激器的针每 10 分钟通过手动旋转进行刺激。电针 45 分钟后立即进行第二次肌肉活检。

图1:电针在人和大鼠骨骼肌中诱导相似的基因表达反应。(a)人体研究设计和程序概述：在患有和未患有多囊卵巢综合征的女性中进行单次电针治疗。(b)基于线性回归分析，15 名多囊卵巢综合征女性单次电针 (EA) 后 mRNA 表达增加最大的 6 个基因和 5 个参与骨骼肌肌肉功能和代谢的选定基因(q <  0.05); 数据表示为平均值±SD。由全基因组阵列鉴定的所有差异表达基因均列于补充表 S2  中。(C)单次电针 (n = 9) 和非刺激对照 (n = 5) 后大鼠骨骼肌 (EDL) 基因表达；数据表示为倍数变化 (fc) 的平均值 ± SEM，并使用 Mann-Whitney U 检验进行分析；## P  < 0.01，### P  < 0.001。

生化分析

如前所述通过 GC-MS/MS 测量循环中的性激素水平，通过放射免疫测定法测量 17α-羟基孕酮。萨尔格伦斯卡大学医院临床化学系的认可实验室分析了胰岛素、糖化血红蛋白 A1c (HbA1c)、总胆固醇、甘油三酯、载脂蛋白 A1、载脂蛋白 B、性激素结合球蛋白、促黄体激素和促卵泡激素。用人类糖尿病 C 肽磁珠组(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)测量血清 C 肽。

大鼠研究程序

动物实验得到了瑞典哥德堡大学动物伦理委员会的批准，并遵循了《实验动物护理和使用指南》。雌性 Wistar 大鼠(Charles River，Frankfurt，Germany)到达 13 周龄，并随意喂食标准食物(Harlan Teklad Global Diet，Frankfurt，Germany)。进行阴道涂片以通过显微镜分析确定发情周期阶段。选择发情期大鼠进行正常血糖-高胰岛素钳夹，随机分为无刺激组(n=5)和低频电针组(n=9)。在麻醉大鼠(Inactin 150 mg/kg，ip；Sigma-Aldrich，St.Louis，LA)中进行正常血糖-高胰岛素钳夹。将导管插入右颈静脉以持续输注胰岛素 (8 mU ∙ kg -1 ∙min -1) 和 20% 的葡萄糖盐溶液以维持 6 mmol/L 的葡萄糖浓度。从左颈动脉抽取血液，每 5 分钟测量一次血糖水平(OneTouch Ultra 2，LifeScan，Inc.，Milpitas，CA)。在稳定状态下，将 2 根针灸针(0.20 × 15 mm，HEGU Svenska AB，Landsbro，Sweden)双侧插入腹直肌(对应穴位 ST27-ST29)，2 根针插入小腿三头肌(对应 SP6和 SP9)。所有穴位都位于与卵巢和胰腺相同的神经支配区域对应的体细胞节段中。插入后，将针连接到电刺激器(CEFAR ACU II；Cefar-Complex Scandinavia，Sweden)并接受低频刺激(2 Hz)，导致可见的肌肉收缩 45 分钟。电针45分钟后，观察大鼠60分钟。无刺激组的动物进行相同的程序，但不插入针头。通过斩首对大鼠实施安乐死，并收获趾长伸肌(EDL)进行分子分析。

肌管的体外电脉冲刺激

从健康男性和女性志愿者的股外侧肌的人体肌肉活检样本中建立了卫星细胞的细胞库。活检是在知情的书面同意和卡罗林斯卡研究所(瑞典斯德哥尔摩)区域伦理审查委员会的批准下获得的。如前所述，肌肉细胞生长和分化。用 PBS 洗涤在 6 孔板中生长的完全分化的肌管，每孔加入 2 mL 含有 5 mM 葡萄糖的融合后培养基。根据 2 种不同的方案，使用 C-Pace EP Culture Pacer (IonOptix) 对细胞进行脉冲处理。急性暴露为 40 V，脉冲持续时间为 2 ms，脉冲频率为 1 Hz，持续 3 小时。慢性/训练暴露是 40 V 的间隔，脉冲持续时间为 2 ms，脉冲持续时间为 1 Hz，持续 30 分钟，然后休息 3 小时。

基因沉默

诱导分化 6 天后，用 10 nM 的 Silencer Select Negative Control No0.2(编号 4390847)或经过验证的 Silencer Select siRNA 转染以靶向 AKAP13 (s680)、HMOX1 (s194530)、MSX1 (s224066) 和 SRXN1 (s44409，生命科技)。靶基因的选择是基于那些在基线时多囊卵巢综合征和对照之间差异调节的基因，并且这些基因也被电针改变。在肌管中未检测到一个基因，6 个基因在对照组和多囊卵巢综合征之间的倍数变化差异 < 0.2。在剩下的 9 个基因中，中医中药与基因检测科学的融合点研究团队选择了在人类肌管中表达最高的 4 个基因(补充图 S1。用 Lipofectamine RNAiMAX 转染试剂(Invitrogen)在 OptiMEM 减少血清培养基中进行转染。将细胞暴露于相隔约 48 小时的 2 个单独的 5 小时转染期。在最终转染两天后，使用 qPCR 和胰岛素刺激的葡萄糖转化为糖原来估计沉默效率，如前所述 。

RNA 提取和 mRNA 表达阵列

使用 RNeasy Mini Kit (Qiagen) 从 15 名患有多囊卵巢综合征的女性和 14 名健康对照者的活检组织和大鼠骨骼肌中提取骨骼肌 mRNA。使用 EZNA Total RNA Kit (Omega Bio-tek, Norcross, GA) 裂解培养的肌肉细胞并提取 RNA。使用 NanoDrop 分光光度计(Thermo Scientific，Wilmington，DE)估计核酸浓度和纯度，并使用自动电泳站(Experion，Bio-Rad)确定 RNA 质量。

为了评估骨骼肌中的整体 mRNA 表达谱，中医中药与基因检测科学的融合点研究团队使用 HumanHT-12 v4 Expression BeadChips (Illumina) 分析了来自 15 名多囊卵巢综合征女性的分离 mRNA。根据制造商的建议，使用 Illumina TotalPrep RNA 扩增试剂盒(Life Technologies & Invitrogen)进行 cRNA 合成，包括生物素标记。然后将生物素-cRNA 复合物片段化并与 Illumina BeadChip 阵列上的探针杂交。在用 Illumina HiScan 荧光相机观察之前，探针用链霉亲和素-Cy3 进行杂交和染色。Bioconductor 的 Oligo 软件包用于计算稳健的多芯片平均表达量度 。

对于更有针对性的方法，使用定制设计的 TaqMan 低密度阵列微流体卡 (Applied Biosystems) 对 14 名对照和 15 名多囊卵巢综合征女性的 44 个靶基因和 4 个参考基因进行定量实时 PCR 扩增，以及电脉冲刺激 (EPS) 处理的肌管。选择的靶基因是那些在基线时在多囊卵巢综合征和对照之间受到差异调节的基因，并且也受到运动和电针的差异调节。这产生了 89 个基因；然后，中医中药与基因检测科学的融合点研究团队过滤掉非编码区，只保留电针后与多囊卵巢综合征和对照在基线时的表达相反的基因，得到 46 个基因(补充图 S1。最不丰富的基因被排除在外，并且 1 个基因不能用作 TaqMan 测定(补充表 S1。使用 High Capacity RNA-to-cDNA 试剂盒(4387406，Applied Biosystems，Carlsbad，CA)从总 RNA 合成 cDNA，并根据制造商的说明在 ViiA 7 实时 PCR 系统热循环仪上运行阵列卡。NormFinder 算法  用于计算最稳定的参考基因，然后根据HPRT1和TBP的表达对基因表达结果进行标准化，这表明肌肉组织和肌管中的变异性最低。

使用 StepOnePlus Real-Time PCR Systems (Applied Biosystem) 进行 SYBR Green 实时 PCR 反应(Power SYBR Green PCR Master Mix, Applied Biosystem, Hercules, CA, USA)，用于检测和定量大鼠中的 mRNA，以复制基因PCOS 女性电针后最大的表达差异。还使用了用于 SYBR green 检测的特定 PCR 引物对(Assay ID qRnoCED0009272、qRnoCED0004818、qRnoCED0001041、qRnoCED0002473、qRnoCED0007 596，Bio-Rad，Hercules，CA，USA)。使用 NormFinder 将基因表达结果标准化为大鼠中Gapdh的表达，其显示出最低的变异性。用ΔΔCt方法计算基因表达值。

DNA 提取和 DNA 甲基化芯片

对于甲基化阵列研究，使用 QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen) 从 14 名多囊卵巢综合征女性单次电针治疗前后采集的骨骼肌活检组织中分离 DNA。使用 NanoDrop 分光光度计(Thermo Scientific，Wilmington，DE)估计核酸浓度和纯度，并通过凝胶电泳检查 DNA 完整性。

使用 Illumina Infinium HumanMethylation450k 阵列 BeadChip 分析患有多囊卵巢综合征的女性骨骼肌中的全基因组 DNA 甲基化。该阵列包含 485 577 个胞嘧啶探针​​，覆盖 21 231 个 (99%) RefSeq 基因 。DNA 甲基化试剂盒(D5001-D5002，Zymo Research)用于将基因组 DNA 转化为亚硫酸氢盐修饰的 DNA。简而言之，高质量的 gDNA (500 ng) 在 BeadChip 上被片段化和杂交，并用 HiScanQ 扫描仪 (Illumina) 测量信号的强度。

如前所述进行生物信息学分析。简而言之，去除了Y染色体探针、rs-probes和平均检测P值>0.01的探针。经过质量控制和过滤，获得了 481 089 个 CpG 位点的甲基化数据。将 Beta 值转换为 M 值 (M = log2 (β/(1 - β))，用于所有数据分析。然后对数据进行分位数归一化并使用 COMBAT 进行批量校正 。为了改进解释，之后在所有预处理步骤中，数据都被重新转换为从 0%(未甲基化)到 100%(完全甲基化)的 β 值，这些都显示在图中。

荟萃分析

为了研究与此处提供的电针结果相比，单次运动对基因表达变化的相似性，中医中药与基因检测科学的融合点研究团队进行了一项荟萃分析，其中包括 3 项研究，其中包括 16 名年龄在 23 至 33 岁的女性的单次有氧或阻力运动, BMI 为 24 至 27 kg/m 2 ( q <  0.05, GSE43219 , GSE71972和GSE28422 ) 。

通路分析

所有通路分析均使用 R 3.5.2 ( www.r-project.org ) 进行。转录本根据t检验中的 t 统计量进行排序，中医中药与基因检测科学的融合点研究团队使用基因本体 (geneontology.org) 和 R 包集群分析器 将基因集富集分析 (GSEA)  应用于表达阵列数据通过 FDR < 0.05 的基因。GSEA 考虑了具有 1 到 500 个转录本的途径。

母题丰富

进行基序富集分析以确定哪些 DNA 结合转录因子可能通过检测基因调控区域中已知结合基序的富集来调节每个数据集的转录。以 FDR < 0.05 过滤基因并按倍数变化排序，选择增加的前 100 个基因，并从真核启动子数据库 ( https://epd.vital-it.ch ) 中收集它们的启动子。在每个基因的最具代表性的启动子中选择从 -499 到 100 个碱基的区域。使用 MEME 套件 5.0.5 ( http://meme-suite.org ) 和 HOCOMOCO v11 数据库进行基序富集分析。

统计分析多囊卵巢综合征女性与对照组之间临床特征的差异基于 Mann-Whitney U 检验。基于线性回归分析，单次电针前后骨骼肌DNA甲基化和基因表达的变化。FDR 用于校正多重测试。卡方检验用于计算改变的甲基化位点是否偶然超过预期数量。进行 Spearman 相关分析以确定电针引起的葡萄糖输注率变化是否与 DNA 甲基化或基因表达的变化相关。DNA 甲基化和基因表达的人类数据以平均值±标准偏差 (SD) 表示。电针后大鼠骨骼肌中的基因表达不呈正态分布，并用 Mann-Whitney U 检验分析。学生分析了多囊卵巢综合征骨骼肌中的基因表达和单次电针前后以及 EPS 处理的肌管中的对照t检验并表示为平均值的平均值 ± 标准误差 (SEM)。通过双向ANOVA分析胰岛素和siRNA对肌管的影响。所有统计分析均使用 SPSS 软件(版本 24；SPSS，Inc.，Chicago，IL)进行。

结果

临床特征

与没有多囊卵巢综合征的女性相比，患有多囊卵巢综合征的女性有更多的窦卵泡、更大的卵巢、更高的 Ferriman-Gallwey 评分和更高的循环雄激素水平。表格1)。15 名多囊卵巢综合征女性中有 11 名符合所有 3 项鹿特丹标准。如前所述，通过正常血糖-高胰岛素钳夹技术测量，单次 45 分钟的低频电针可增加患有和未患有多囊卵巢综合征的女性的全身葡萄糖摄取量 。

单次电针后骨骼肌基因表达发生变化。

中医中药与基因检测科学的融合点研究团队分析了 15 名多囊卵巢综合征女性骨骼肌中的全基因组 mRNA 表达。在通过错误发现率 (FDR  <  0.05) 对多次测试进行校正后，180 个独特的转录本在单次电针后在骨骼肌中表现出改变的表达(补充表 S2 )。在这些转录本中，PCOS 女性中有 122 个上调，58 个下调，转录本的表达变化范围为 -43% 至 +1146%。表达增加最多的 6 个基因是EGR2、CCL2、GADD45B、ATF3、NR4A2和SLC2A3，并且已知许多已鉴定的基因在肌肉功能和新陈代谢中起重要作用，包括CYR61、EGR1、FOSB、JUNB和MYC(图1a) ( 40-42 )。在一次电针治疗后，还通过 RT-qPCR 在大鼠中测量了其中 5 个基因的基因表达。电针后大鼠骨骼肌中Ccl2、Egr1和Junb以类似方式上调，而Nr4a2和Cyr61的表达未改变。图 1b)。

响应电针的骨骼肌全基因组 DNA 甲基化。

在约 481 000 个分析的 CpG 位点中，60 063 个位点(12.5%)在单次电针后肌肉组织 DNA 甲基化发生了变化(基于P <  0.05，这超出了偶然预期(P  < 0.0001，chi -平方检验))。然而，在 FDR 校正低于 5% ( q  < 0.05) 后，没有位点发生显着变化，尽管 304 个 CpG 位点保持在q <  0.20 且P  = 10 -4(补充表 S3 )。甲基化的绝对变化范围为 -7.7% 至 +3.6%。这些 CpG 位点中的绝大多数(278 个位点；91%)显示出响应电针的 DNA 甲基化降低。

基因表达和DNA甲基化之间的重叠

总共有 180 个独特转录本中的 101 个在电针后表达发生变化，在一个或多个 CpG 位点发生 DNA 甲基化变化(P  < 0.05；总共 347 个 CpG 位点)。在这些 CpG 位点中，大多数(69.5%)发生了甲基化和相反方向的表达变化(图 2和补充表S4)，支持增加甲基化与基因沉默相关的概念。

图 2:超过 50% 的独特转录本在响应电针后表达发生变化，其中一个或多个 CpG 位点被注释到基因上，DNA 甲基化发生了变化。CpG 位点 ( P  < 0.05) 的 DNA 甲基化变化被注释为表达改变的基因 ( q < 0.05)。值是电针之前与之后的变化，以 CpG 位点甲基化的百分比和每个基因名称旁边的基因表达百分比变化表示。基于线性回归分析计算所有改变的基因的 CpG 甲基化位点以及响应电针的 mRNA 表达变化，并在补充表 S4  中给出。

葡萄糖输注速率变化与mRNA表达的相关性

为了确定电针引起的葡萄糖输注速率的变化(通过正常血糖-高胰岛素钳测量)是否与电针引起的基因表达变化(Illumina HumanHT-12 BeadChips 阵列)相关，中医中药与基因检测科学的融合点研究团队进行了 Spearman 相关分析。在电针响应表达发生显着变化的基因中(q <  0.05)，中医中药与基因检测科学的融合点研究团队确定了16个与葡萄糖输注速率增加相关的基因，包括KLF4、NR4A2、ID3和PIM1(P  < 0.05)。八个基因也有几个 CpG 位点，它们注释的甲基化减少(补充表 S5 )。

调节区域中已知结合基序的富集

接下来，中医中药与基因检测科学的融合点研究团队进行了基序富集分析，以确定哪些 DNA 结合转录因子可能是多囊卵巢综合征女性和/或电针或运动反应中发生改变的基因组的直接调节因子。根据生理或病理刺激，转录因子 SP1-4 作为基因表达的激活因子或抑制因子，预测这些转录因子调节所有基因组中的基因表达。图 3a和补充表 S6)。与对照组相比，转录因子 PATZ1、KLF15 和 MAZ 可能与多囊卵巢综合征女性中发生改变的基因结合，而 WT1、EGR2 和 KLF3 预计与对运动和电针的反应有关。图 3a)。六种转录因子分别在运动和电针后改变了基因表达(图 3b-c)，而FOXO3在多囊卵巢综合征女性与对照组女性中上调(图 3d)。EGR1、EGR2和ATF3是在运动和电针刺激下表达增加最多的转录因子转录物。

图 3:转录因子可能是多囊卵巢综合征女性基因组改变的直接调节因子，或者是对电针或运动的反应。(a) 每种条件下倍数增加最大的前 100 个基因的基序富集分析，以及补充表 S6 。基于线性回归分析，转录因子基因表达的倍数变化 (Fc) 响应于 (b) 电针、(c) 运动和 (d)多囊卵巢综合征( q <  0.05)。

电针和运动在基因表达和信号通路上表现出相似的变化

接下来，中医中药与基因检测科学的融合点研究团队搜索了响应电针显着改变其表达的基因与中医中药与基因检测科学的融合点研究团队之前发表的研究中发现的患有和未患有多囊卵巢综合征的女性之间差异表达的骨骼肌基因之间的重叠 ，所有这些都由 Illumina HumanHT-评估。 12 个 BeadChip 阵列。在多囊卵巢综合征女性骨骼肌中发现的 2200 个差异表达基因中(P  < 0.05)，其中 57 个因电针而受到调节(q <  0.05，图 4a, 补充表 S7  )，其中 54 个基因 (95%) 的变化指向健康表型，如CCL2、CYR61、DYRK2、IRS1、LDLR、MSX1、SLC2A3、SORBS1和SRXN1 所示(图 5)。接下来，中医中药与基因检测科学的融合点研究团队确定了患有和未患有多囊卵巢综合征的女性骨骼肌中差异表达基因和因电针而发生变化的基因的负相关性(rs =  -0.79，图 4b)。根据基因本体分析，电针反应最丰富的信号通路包括参与调节糖代谢和肌肉组织发育的信号通路,图 4d)。电针下调多囊卵巢综合征女性的肌肉和结缔组织发育通路上调，而电针下调糖原生物合成通路。有助于富集前 10 个上调和下调基因组的基因显示在补充表 S8  中。

图 4:一轮电针或运动显示出基因表达变化和信号通路的相似性。比较响应电针、运动和多囊卵巢综合征的基因和通路。(a)电针 ( q <  0.05)、运动 ( q <  0.05) 和多囊卵巢综合征( P < 0.05)显着修饰的基因数量 在维恩图中重叠。( b)电针显着改变的基因倍数变化 ( q <  0.05) 与多囊卵巢综合征女性基因改变的相关性。斯皮尔曼r  = -0.79。(c)运动显着改变基因倍数变化的相关性(荟萃分析，q <  0.05)在本研究中通过电针修饰基因。斯皮尔曼r  = 0.59。(d)使用基因本体论对电针 ( q <  0.05)、运动 ( q <  0.05) 或多囊卵巢综合征( P  < 0.05) 显着修饰的基因进行过度表征分析。

图 5:许多响应电针而受到调节的基因向更健康的表型转变。在电针 (EA) (* P < 0.05 ) 之前，PCOS 与对照组的肌肉中基因差异表达(* P  < 0.05)，并且在单次针灸后基因发生变化(# q  < 0.05)。数据表示为倍数变化平均值 ± SD 并用学生t检验进行分析。所有差异表达基因之间的重叠显示在补充表 S7  中。

为了确定骨骼肌和脂肪组织之间可能的相似性和串扰，中医中药与基因检测科学的融合点研究团队在本研究中的肌肉和先前研究的脂肪组织中寻找其表达因电针而改变的基因之间的重叠 ，所有这些通过全基因组表达差异进行评估。在 180 个因电针而在骨骼肌中表达改变的基因中，114 个在脂肪组织中也发生了改变(补充表 S9 )，其中 100 个重叠基因(88%)在两者中的调控方向相同组织。

为了确定在健康女性中对单次低频电针和单次运动的基因表达变化的任何相似性，中医中药与基因检测科学的融合点研究团队对 3 项在年龄相近但年龄相仿的女性中进行单次运动的研究进行了荟萃分析。 BMI 略低 。在这些研究中，42 个在骨骼肌运动后改变表达的基因(q <  0.05)在本研究中也响应电针而改变了表达，34 个基因上调，8 个下调(图 4a，补充表S10。在响应电针的 50 个最上调的基因中，38% 的基因也响应运动上调。本研究中电针诱导的基因表达变化 ( q <  0.05  ) 与1 轮运动后的基因表达变化(q < 0.05)之间存在强正相关性进一步证实了这一点  ( rs  = 0.59,图 4c)。基因本体分析显示，17条丰富的信号通路中有9条在电针和运动之间有重叠(图 4d)。

然后，中医中药与基因检测科学的融合点研究团队应用了一种有针对性的方法来确定单次电针是否以相同的方式改变了患有和未患有多囊卵巢综合征的女性的基因表达。在 Illumina HumanHT-12 BeadChips 阵列先前鉴定的 44 个基因中，这些基因在多囊卵巢综合征女性中受电针调节，其中 33 个通过 RT-qPCR 技术验证，使用具有相同样本的低密度阵列卡。表 2)。在未验证的 11 个基因中，有 9 个在全基因组基因表达阵列中表现出降低的表达，与上调基因相比，倍数变化较小。中医中药与基因检测科学的融合点研究团队发现，在有和没有多囊卵巢综合征的女性中，33 个经过验证的基因中有 21 个的表达在电针治疗后发生了相同的变化，其中 20 个被上调，1 个被下调。图 6a-d,表 2)。在对照组和患有多囊卵巢综合征的女性中，电针对 15 个基因的调控方向不同，包括PRINS 、 AKAP13 、 HMOX1 、 MSX1和SRXN1