【佳学基因检测】具有复杂临床表现的疾病的基因检测：高胰岛素血症

内分泌及遗传代谢科基因检测导读：

先天性高胰岛素血症的特征是低血糖时胰岛素释放不当。这种可能危及生命的疾病可以单独发生，也可以作为综合征疾病的特征出现。确定高胰岛素血症的潜在病因对于指导这种情况的医疗管理至关重要，特别是在患有二氮嗪无反应性高胰岛素血症的儿童中，其中潜在的遗传学决定了是否存在局灶性或弥漫性胰腺疾病。已知影响 30 多个基因的致病单核苷酸基因突变会导致持续的高胰岛素血症，其中 KATP 通道基因（ABCC8和KCNJ11 ）发生突变) 最常见于患有严重持续性疾病的儿童。先天性高胰岛素血症也很好地描述了甲基化缺陷、染色体数目的变化以及破坏多个基因的大量缺失和重复，进一步突出了这种情况的遗传异质性。新一代测序彻底改变了先天性高胰岛素血症的基因检测方法，靶向基因组、外显子组和基因组测序是在单一反应中分析多种疾病基因的高灵敏度方法。但应该认识到，下一代测序仍然存在局限性，没有单一的应用程序能够检测所有报告的遗传基因突变形式。

基因检测关键词

高胰岛素血症，低血糖，基因筛查，遗传学，二代测序 - NGS

高胰岛素血症及其基因检测诊断的必要性

持续性先天性高胰岛素血症 (HI) 的特征是在持续超过 3 个月的低血糖期间胰岛素分泌不当。及时诊断高胰岛素血症和有效管理血糖水平对于预防不良后果至关重要。

持续性高胰岛素血症影响非近亲人群中大约 13,500 分之一到 45,000 分之一的新生儿。在一些报告了创始人突变的孤立社区中，以及在具有高血缘关系的人群中，发病率可能会增加到大约 3,000 分之一 。至少有 36 种不同的高胰岛素血症遗传原因已被报道，它们遵循隐性、显性、X 连锁或散发性遗传(表格1）。潜在的遗传病因将确定高胰岛素血症是表现为孤立的胰腺疾病还是作为罕见综合征的一部分出现。

表格1：孤立的先天性高胰岛素血症的已知遗传原因和目前对该病症进行基因检测的方法。勾号 (✓) 或叉号 (X) 表示是否可以通过筛选方法检测到遗传基因突变的形式。甲基化研究或阵列 CGH 分析不会检测到列出的变体。SNV 是单核苷酸变体，Indel 是插入/缺失变体，CNV 是拷贝数变体（缺失和重复）。

¹ Sanger 测序不会检测超出目标区域的重复的杂合缺失。包含引物结合位点的纯合缺失可以通过未能扩增序列来检测，但这需要通过独立方法进行验证。

² 外显子组测序不会检测到这些基因中报告的深度内含子突变或启动子突变 。

许多实验室提供先天性高胰岛素血症的基因检测；然而，在筛选的基因和可以检测到的基因突变类型方面，测试中心之间的策略各不相同。每个实验室采用的不同测试方法可以帮助解释队列之间突变阳性病例百分比的差异，范围从 45% 到 79%。此外，导致高胰岛素血症的大量基因、在具有相同致病基因突变的家族内部和家族之间观察到的可变外显率以及报告的多种遗传模式可能会阻碍遗传解释，这也将影响报告的拾取率每个实验室。

在高胰岛素血症的基因检测应用中，遗传及代谢科特征性基因检测项目论证团队描述了高胰岛素血症的遗传原因，并讨论了目前用于这种情况的遗传筛查的不同方法的益处和局限性。

先天性高胰岛素血症的遗传类型

据报道，10 个基因中的致病基因突变会导致孤立的、持续的 HI(表1）。ABCC8和KCNJ11基因的功能丧失基因突变体编码胰腺 β 细胞 ATP 敏感钾 (KATP) 通道的两个亚基，是最常见的，在 30-66% 的基因检测病例中有报道 。 广泛的临床严重程度与 KATP-HI 相关，其中功能最温和的基因突变导致短暂的疾病，对二氮嗪治疗（HI 的一线药物）反应良好，而功能最严重的基因突变导致二氮嗪无反应的高胰岛素血症持续整个儿童期。对于二氮嗪无反应的高胰岛素血症患者，可能需要进行胰腺切除术以预防危及生命的低血糖。对于这些婴儿，KATP 通道基因的快速基因检测至关重要，因为它将确定疾病的组织学亚型。识别双等位基因（相反等位基因上的两个致病基因突变）或单个显性 KATP 通道致病基因突变证实了弥漫性胰腺疾病。相比之下，发现父系遗传的隐性 KATP 通道基因突变体可预测局灶性疾病，敏感性为 97% 。在这些个体中，胰腺内的第二个体细胞遗传事件使变体成为纯合子（单亲同源异构体）。这可以通过在病灶切除术后检测胰腺组织进行基因确认，这在大多数情况下被证明是有效的。

临床特征有助于预测孤立性高胰岛素血症的某些遗传形式。例如，高氨浓度是GLUD1- HI  的一致特征，成熟期发病的年轻糖尿病 (MODY) 家族史可以预测HNF4A或HNF1A -HI ，以及运动诱发的 HI表明β细胞不允许基因SLC16A1在疾病发病机制中的作用。

超过 28 种不同的以高胰岛素血症为特征的综合征已被报道，其中最常见的是 Beckwith-Wiedemann 综合征 (BWS) 和歌舞伎综合征  (表 2）。患有高胰岛素血症的综合征患者的比例因遗传亚组而异。在某些情况下，HI 被报告为主要特征 [例如 Beckwith-Wiedemann 综合征 ]，而对于其他情况，它被报告为疾病的罕见特征 [例如染色体 9p 缺失 ]。如果没有基因检测，可能很难准确诊断综合征疾病，尤其是当高胰岛素血症是表现特征并且在出生后出现畸形时，或者当临床特征不是遗传综合征特有的时 。对于患有综合性高胰岛素血症的个体，基因诊断很重要，因为它将告知预后并允许有效监测疾病的新特征。

表 2:先天性高胰岛素血症可能是一种罕见或常见特征的综合征疾病的已知遗传原因，以及目前对这种情况进行基因检测的方法。勾号 (✓) 或叉号 (X) 表示是否可以通过筛选方法检测到遗传基因突变的形式。甲基化研究是指可以检测 DNA 甲基化模式变化的方法（例如 Epic 阵列分析、甲基化特异性 MLPA）。SNV 是单核苷酸变体，Indel 是插入/缺失变体，CNV 是拷贝数变体（缺失和重复）。

¹ Sanger 测序不会检测超出目标区域的重复的杂合缺失。包含引物结合位点的纯合缺失可以通过未能扩增序列来检测，但这需要通过独立方法进行验证。

² 先天性高胰岛素血症、重度先天性感觉神经性耳聋、肠病和肾小管功能障碍是由 ABCC8 和 USH1C 上的连续缺失引起的。

³ Chr11p15.5 印记区域的罕见缺失和重复可导致 Beckwith Wiedemann 综合征 。它们的大小和位置将决定它们是否可以通过下一代测序或微阵列分析来检测。

⁴ MAGEL2 是一种印记基因，功能丧失突变仅在父本等位基因上存在时才会引起疾病。

⁵ 已报道影响 NSD1 的基因间突变；这些不会被外显子组测序检测到（ 55）。

桑格测序

历史上通过 Sanger 测序筛选了高胰岛素血症的致病基因；一种允许数百个核苷酸（通常是单个外显子）在单个反应中快速测序的方法。随后通过比对和检查 DNA 序列进行半自动分析。这些限制迫使实验室根据临床特征和基因中致病基因突变的常见程度，按照先验概率的降序依次筛选基因。虽然这种表型驱动的方法在许多情况下效果很好[例如在快速筛选患有二氮嗪无反应疾病的个体中的 KATP 通道基因 ]，依赖临床特征来指导测试可能会延迟具有非典型表现的个体的基因诊断。这是高胰岛素血症的一个重要考虑因素，因为在大多数遗传亚组中都描述了表型基因突变性，例如在一些患有GLUD1 -HI 的儿童中存在正常的氨水平。使用临床特征来指导综合性高胰岛素血症的基因检测也应谨慎应用，因为在高胰岛素血症诊断后可能会出现其他特征 。

Sanger测序的另一个主要限制是它无法检测到超出目标区域的杂合缺失和重复、染色体数量的变化（非整倍体）和甲基化缺陷，据报道，所有这些都会导致HI（表1）。

尽管存在局限性，但 Sanger 测序仍然是一种高度敏感的测试，用于快速检测基因组编码区和非编码区中的单核苷酸基因突变和小的插入/缺失基因突变 (indel)。它还可以检测样本组织中存在的镶嵌基因突变体（即在细胞分裂过程中引入的遗传基因突变体，不会影响身体内的每个细胞），其含量 > 8% 。这一点很重要，因为已知高胰岛素血症基因包括KMT2D、KDM6A、NSD1和CREBBP 中都报告了引起疾病的镶嵌基因突变体。

下一代测序

自 2005 年以来，新一代测序提供了一种方法，允许在一次测定中同时分析多个基因 。这项技术彻底改变了遗传异质性疾病（如 HI）的诊断测试，它允许在一次检测中以比 Sanger 测序低得多的成本并行筛选所有已知的致病基因/基因组区域。这导致了症状性高胰岛素血症等疾病的范式转变，其中基因检测可以先于疾病的全部临床谱的发展，用于做出而不是确认临床诊断 。

通过下一代测序进行靶向基因面板分析

靶向基因组通常包括疾病的所有已知遗传原因，并且 DNA 样本在下一代测序之前富集了这些基因座中的 DNA。对于大多数靶向基因 panel，实现的平均覆盖率通常在每个碱基上达到数百个读数 。这种高深度测序数据可用于检测目标区域拷贝数的变化，并允许准确检测以 >1% 的水平发生的镶嵌基因突变 。最近的研究表明，可以分析测序过程中产生的脱靶读数，以评估整个基因组的读数深度，从而检测目标区域外的大缺失和重复。这些脱靶读数已成功用于检测高胰岛素血症患者 9p 染色体上的致病缺失 。但是，从脱靶读取中识别大量缺失和重复的可能性将取决于用于靶向下一代测序的方法；对 PCR 产物进行测序的基于扩增子的方法不会产生脱靶测序数据。

靶向二代测序的主要限制是它只允许筛选预先确定的基因组区域列表，并且该列表通常在实验室之间有所不同。因此，对于高胰岛素血症等遗传异质性条件，订购 panel 测试的临床医生必须了解目标 panel 中包含哪些基因以及是否进行了拷贝数分析，因为这需要单独的生物信息学分析。

外显子组和基因组测序

新一代测序技术的引入使得所有基因（外显子组）或整个人类基因组（编码区和非编码区）的编码区的快速测序成为可能，而且成本远低于以前的方法。解释外显子组和基因组测序数据的方法在中心之间会有所不同，其中一些分析变体在一组预定义的已知致病基因中被调用，而其他实验室将进行基因不可知分析。后一种方法的优点是能够识别高胰岛素血症的新基因，最近的成功包括发现综合征高胰岛素血症基因CACNA1D、PMM2、FOXA2、TRMT10A、EIF2S3、YARS和KMT2D通过外显子组测序和最近通过基因组测序在孤立的高胰岛素血症个体中发现 β 细胞不允许基因HK1的内含子 2 深处的调节基因突变。实验室利用下一代测序数据进行基因发现的能力在很大程度上取决于他们进行稳健的基因和功能研究以评估新基因突变的能力。

外显子组测序针对编码蛋白质的基因组的约 2%，使其成为基因组测序的更便宜的替代方案。这一点，再加上 85% 的已知致病突变位于编码区，导致外显子组测序在临床环境中被广泛采用 。例如，在英国，急性不适新生儿的快速外显子组测序可通过该国的国家卫生服务获得，38% 的患者接受了快速诊断。与筛选预定基因列表的靶向二代测序不同，外显子组测序提供了一种极其有效的方法，可以全面分析所有已知高胰岛素血症基因的编码区和内含子/外显子边界，并评估拷贝数状态。该方法的主要限制是它不能检测非编码突变，例如ABCC8、HADH和HK1中报道的深度内含子突变或HNF4A、PMM2和SLC16A1等基因中的启动子基因突变。

基因组测序代表了基因检测的黄金标准方法，因为它能够检测到最大范围的遗传基因突变。除了提供关于编码和非编码区域的数据外，基因组测序还可用于搜索结构变化、拷贝数基因突变（大缺失、重复和非整倍体）和镶嵌基因突变，尽管所获得的读取深度较低，因此不太敏感与靶向二代测序相比，检测低水平镶嵌基因突变的方法。

与整个基因组测序相关的成本和产生的大量数据（每个样本大约 200GB 的处理数据，而外显子组测序的每个样本大约 11GB）阻碍了常规基因组测序的采用。直到最近，当靶向下一代测序或外显子组测序未检测到致病基因突变时，它主要用于基因筛查。这种方法的成功导致许多罕见遗传疾病的诊断率增加 。

测序能力的提高导致成本降低，尽管现在导致基因组测序作为特定医疗保健环境中的一线诊断测试出现，例如在英国国家医疗保健服务 (National Health Service) 中筛查一些罕见的发育障碍 。虽然基因组测序不是目前在许多中心调查高胰岛素血症遗传原因的方法，但它似乎有可能成为未来几年的一线测试。

检测拷贝数基因突变和甲基化缺陷的非测序方法

非整倍体和大量缺失和重复（拷贝数基因突变）是高胰岛素血症的罕见但重要的原因（表 1和2）。与 Sanger 测序不同，新一代测序可以检测这些形式的遗传基因突变，但许多实验室不会常规筛查它们，因为需要单独的分析管道。当在高胰岛素血症儿童中未检测到致病基因突变时，这是一个重要的考虑因素，特别是对于那些有其他综合征特征的儿童（表 2）。

多重连接依赖性探针扩增 (MLPA) 可以检测高胰岛素血症个体中引起疾病​​的缺失和重复。这种方法通常用于筛选ABCC8基因中的缺失，并且可以检测嵌合体。MLPA 的用处受限于它在一次测定中分析最多 60 个不同的小基因组区域（通常是单个外显子）的能力，因此阻止了同时分析所有已报告拷贝数变化的高胰岛素血症基因。

基于微阵列的比较基因组杂交 (array CGH) 是一种成熟的方法，用于检测高胰岛素血症个体中的大缺失/重复和非整倍体。与 MLPA 不同，阵列 GCH 无法检测到低水平的嵌合体（缺失和重复的嵌合体 <30%，非整倍体的嵌合体 <10%）。然而，该方法确实允许分析更大百分比的基因组中的拷贝数基因突变，尽管目标区域会因阵列而异，并且并不总是以足够精确的方式靶向已知导致高胰岛素血症的区域。

目前的诊断测序方法也无法检测 DNA 甲基化的变化。因此，临床怀疑有印迹疾病（例如 Beckwith-Wiedemann 综合征）的个体可能需要额外的甲基化研究，例如甲基化特异性 MLPA (MS-MLPA)  或 Infinium 甲基化 EPIC 阵列分析 。新兴技术，如牛津纳米孔测序，可能允许同时检测序列基因突变和 DNA 甲基化状态，但尚未广泛应用于临床。这项技术确实为高胰岛素血症等遗传异质性疾病提供了单一综合测试的希望，尽管迄今为止它主要用于难以通过其他方法测序的基因。

进一步的考虑和结束语

HI 的诊断测试通常对从外周血白细胞、唾液或口腔样本中提取的 DNA 进行。对于高胰岛素血症等疾病，考虑筛选的 DNA 来源很重要，因为已经报道了仅存在于胰腺组织中的体细胞突变 。因此，如果在血液中未发现突变，并且已经进行了胰腺切除术，则应考虑重新测试已知的高胰岛素血症基因以寻找仅存在于胰腺 DNA 中的变体。

总之，有几种不同的遗传方法可用于高胰岛素血症的常规诊断筛查，其中基因组测序代表了测试的金标准方法。对于管理这种遗传异质性疾病的医疗保健专业人员，重要的是要认识到包括基因组测序在内的每种方法的局限性，因为没有单一的测试可以检测高胰岛素血症报告的所有已知类型的遗传基因突变。这在管理综合征性疾病时尤其重要，其中拷贝数基因突变或甲基化缺陷很常见。尽管有广泛的基因筛查方法可用于 HI，但实际上测试策略最有可能受到当地基因诊断实验室能力的影响，可负担性，重要的是测试执行速度和结果报告的速度。这对于患有二氮嗪无反应疾病的儿童尤其重要，因为确定父系遗传的 KATP 致病基因突变表明局灶性胰腺疾病可以通过病变切除术治愈。

Congenital Hyperinsulinism: Current Laboratory-Based Approaches to the Genetic Diagnosis of a Heterogeneous Disease.

Hewat TI, Johnson MB, Flanagan SE.Front Endocrinol (Lausanne). 2022 Jul 7;13:873254. doi: 10.3389/fendo.2022.873254. eCollection 2022.PMID: 35872984