【佳学基因检测】循环肿瘤DNA（ctDNA)检测与分析技术

肿瘤基因检测导读：

基因突变和DNA甲基化是ctDNA检测的两个主要组成部分。肿瘤驱动基因的改变往往会打破原癌基因和肿瘤抑制基因之间的动态平衡，促进癌基因的表达，从而导致肿瘤。此外，驱动基因的改变往往是单碱基变化，这对于极低含量的ctDNA的检测是一个很大的挑战。DNA甲基化对ctDNA检测也是关键。驱动基因中的胞嘧啶上的甲基过量可能会通过影响转录因子与其目标片段的结合，阻碍转录。因此，就引发肿瘤发生的角度而言，DNA甲基化与DNA突变起着相同的作用。针对这方面，研究人员已经开发出许多有效的检测方法，以下将对其进行回顾。

ctDNA的突变检测

基于PCR的检测

根据PCR的原理，开发出了一系列与PCR相关的方法，也已应用于ctDNA的检测。这些方法包括扩增难性突变系统-PCR（ARMS-PCR）；低变性温度共扩增-PCR（COLD-PCR）；滴定数字PCR（ddPCR）；珠子、乳液、扩增和磁性（BEAMing）；qPCR。

（1）ARMS-PCR

ARMS-PCR也被称为等位基因特异性PCR。其检测原理是通过3'端引物设计控制等位基因特异性扩展，并结合TaqMan探针法检测荧光信号值，从而区分野生型等位基因和突变基因。Maryam等人使用四引物扩增难性突变系统-聚合酶链反应(T-ARMS-PCR)方法准确地检测了大肠癌患者血样中脂肪质量和肥胖相关基因(FTO)的多态性(rs9939609)。研究发现，大肠癌患者的疾病进程与rs9939609多态性的A等位基因呈正相关，但其潜在机制需要进一步探究。同样，ARMS-PCR方法被用于检测43例接受芳香酮抑制剂治疗的转移性乳腺癌患者中的ESR1的突变率，突变率为27.9% (12/43)。为了证明该方法的准确性，还比较了ARMS-PCR和绝对定量ddPCR之间的ESR1的检测率，发现两种方法的检测一致性为95.45%(p < 0.001) 。总的来说，ARMS有着高敏感性和准确性，操作便利，成本低。然而，由于该方法需要针对突变目标进行引物设计，因此在早期阶段需要对引物进行大量筛选以优化。与Sanger测序和下一代测序相比，它无法实现高通量和高位点的检测。

（2）COLD-PCR

COLD-PCR是近年来开发的一种低温PCR，解决了传统PCR在敏感性和特异性低的缺点。在DNA双链合成过程中，单核苷酸的交替使得序列的变性温度产生小而可预测的变化。在COLD-PCR中，为了生成突变基因和野生型等位基因之间的分子杂交，PCR周期中应设定一个退火温度。异型双链杂交的退火温度低于同型双链杂交的退火温度。因此，在扩增过程中，当同型双链仍处于双链状态时，异型双链杂交已经在较低的退火温度下退化，无法有效扩增。通过在较低的退火温度设定变性温度，COLD-PCR可以在任何地方大量扩增突变体，而野生型含量保持不变。从而实现了丰富突变基因的目标，可用于检测低丰度DNA。肿瘤的高精度基因检测利用COLD-PCR和微流体数字PCR的联合方法检测到了甲状腺乳头状癌患者血浆中的显著BRAF V600E突变(cfBRAF V600E)，联合方法的敏感性比单一数字PCR提高了100倍以上。此外，cfBRAF V600E与肿瘤大小、肺微转移和甲状腺外大面积扩展相关，表明它可能是乳头状甲状腺癌进展的独立因素。在进行二代测序或数字PCR的绝对定量之前，进行了增强冰冷-COLD-PCR以丰富模板，丰富效率比数字PCR高出100倍，大大提高了对转移性雌激素阳性乳腺癌患者血样中的ESR1基因突变的检出率。Silvia等人通过COLD-PCR、微阵列和ddPCR比较了转移性结直肠癌患者基因突变的检出率。在血样方面，COLD-PCR的检测一致率最高，达到92.6%。总的来说，COLD-PCR在检测稀有和低含量突变方面有很大优势，但其主要功能是丰富检测模板，需要与其他检测方法，如ddPCR和下一代测序，结合使用，才能在ctDNA检测中发挥更大作用。

（3）BEAMing

由肿瘤精准基因检测提出的BEAMing是一种具有高可靠性和高敏感性的单一DNA分子的测量和定量方法。主要过程包括：引物和磁珠的特异性组合，通过包覆引物的DNA模板和探针在油相中形成微乳液，油相中的PCR，通过磁性对PCR后的磁珠进行纯化，识别不同的DNA分子，最后通过流式细胞仪、荧光显微镜、LSR I 和 II等多种方法进行DNA的检测。

BEAMing由于其高敏感性，已成为许多临床基因检测选择检测ctDNA的工具。肿瘤无创基因检测利用BEAMing技术验证了单一部位转移的216例结直肠癌患者RAS基因突变在液体活检中的一致性，对于肝转移，其一致性达到91%，不考虑肿瘤最大直径和病灶数量等影响因素，这表明ctDNA中的基因突变分析可能用于预测肿瘤转移部位。BEAMing也被用于检测具有100%特异性的胶质母细胞瘤患者的ctIDH1突变，这种突变表示患者有更好的生存预后。Krug等人结合了外泌体RNA和ctDNA，使用针对性的下一代测序面板和BEAMing来提高检测EGFR突变的敏感性，从而制定合理的治疗管理策略。

（4）ddPCR

ddPCR也被称为第三代PCR技术，是一种比ARSM (0.1%)和Sanger (10%)测序具有0.01%检测限的DNA的绝对定量方法。这种方法的一个特点是PCR在水油乳滴中进行，且在读数器中检测荧光信号。而在这种方法中，样品的浓度并不影响荧光信号的强度，因此ddPCR不需要内部标准物。在突变检测中，ddPCR主要通过两个探针（野生型和突变型）来检测荧光信号。根据荧光信号的种类和强度，可以判断出样品中野生型和突变型的含量。其中，FAM标记的突变探针和HEX标记的野生探针是最常用的组合[67]。

基于测序的检测

（1）NGS

随着计算机科学和生物信息学的进步，测序技术逐渐被应用于分子生物学领域以验证DNA序列。而且，测序技术的广度和深度已经从Sanger测序发展到下一代测序，再到单分子测序。对于低含量的ctDNA，测序是一种准确的检测方法。下一代测序(NGS)也被称为高通量测序，是通过并行化，使得每次测序可以读取数亿条DNA序列，从而在一次实验中获取大量数据。根据NGS的原理，可以分为基于合成的测序（Illumina、Complete Genomics）、基于连接的测序（SOLiD/ABI-生物系统）、基于金字塔测序（454/Roche）和基于照片测序（Helicos）四种类型。

根据具体应用，NGS可以分为全基因组测序（WGS）、全外显子测序（WES）、全转录组测序（RNA-seq）、ChIP-seq等四种类型。其中，全基因组测序和全外显子测序最常用于ctDNA的突变检测。全基因组测序和全外显子测序的主要区别在于覆盖范围，全基因组测序覆盖全基因组所有区域，包括编码区和非编码区；而全外显子测序仅覆盖编码区。因此，全基因组测序需要更大的测序深度，成本更高，而全外显子测序覆盖范围小，测序深度较浅，成本较低。

特异性扩增

另一种主要用于突变检测的方法是特异性扩增。这种方法的优点是其灵敏度高，限制仅在于扩增的特异性。主要有两种特异性扩增的方法：一种是基于时间的特异性扩增，例如PCR梯度扩增和阻滞扩增；另一种是基于空间的特异性扩增，例如位点特异性扩增。酶是具有高效率和亲和力的生物活性物质。一类酶，如传统的限制酶，可以切割DNA或RNA。一旦DNA序列包含与切割位点相对应的限制酶，就会被精确切割。近年来，随着基因编辑技术的快速发展，一种非传统的限制酶也可以被用来高效切割目标片段。为了在丰富的野生型分子背景下检测到非常少的ctDNA突变，这种酶专门切割大量的野生片段，以增加突变含量的百分比。然后，通过各种扩增技术，增加突变片段的净含量。结合测序和其他信号检测方法，可以成功检测ctDNA中目标基因的突变。

(1) CRISPR/Cas9 + PCR

CRISPR-Cas系统被称为“基因剪辑剪刀”，是在古细菌中发现的一种保护机制，它可以特异性地定位和切割外源序列。最常用的系统有Cas9，Cas12和Cas13。他们的“基因剪刀”功能并非通用，而是受到PAM位点的限制，它们的剪切目标不同。Cas9用来切割双链DNA，相应的PAM位点是5‘-NGG-3’。双链DNA或单链RNA可以被Cas12切割，相应的PAM是5' -TTN/TTTN-3'。特别是，Cas13适用于切割RNA，仍然受到原始空间序列而不是PAM位点的限制。值得一提的是，当目标片段被Cas12和Cas13特异性切割后，就会激活转移切割，可以非特异性地切割富含T的序列。

基于CRISPR-Cas系统的特异性切割目标片段的特点，肿瘤精准治疗基因检测将CRISPR-Cas9和传统PCR结合起来，实现了对NSCLC中EGFR第19外显子中最常见的缺失突变的检测。他们为缺失片段设计了一个目标单链向导RNA (sgRNA)，并在sgRNA的指导下，Cas9与目标序列结合，实现了对野生序列的特异性切割。突变序列没有受到影响，并在PCR扩增过程中持续富集。通过Sanger测序，实现了突变序列的识别，检出限为0.01%。虽然灵敏度高，但操作极为复杂。Cas9的酶活性温度为37°C，在PCR过程中很容易被灭活。因此，需要在反应过程中连续添加Cas9，以维持其酶消化功能。基于这个原理，Lee等人检测了ctDNA中的KRAS突变。此外，Chen等人提出了一种将Cas9与石墨烯结合以检测EGFR突变的方法。通过还原L-抗坏血酸，将金（Au）、铂（Pt）和钯（Pd）掺入三维石墨烯材料中，形成Au-Pd-Pt纳米花装饰的三维石墨烯，并将其固定在玻碳电极上。石墨烯检测平台配备了一种捕获探针，称为熵驱动链位移反应（ESDR）。在Cas9和目标sgRNA的作用下，突变模板可被剪切，从而提供扩增循环的目标引物。在扩增循环中，与捕获探针互补的T1片段可以生成，并通过电场中的电流实现检测信号。该方法放弃了常规的PCR富集过程，节省了检测时间和处理过程，并具有0.13 pM的高灵敏度检测限。同时，CRISPR-Cas9剪切触发的ESDR纳米花生物传感器在临床样本中具有高准确性。

还有一种名为非活化的Cas9蛋白（dCas9）的不活性Cas9蛋白，它不干扰sgRNA对目标片段的识别，但不能特异性地切割目标片段。利用氧化石墨烯丝印电极（GPHOXE）与dCas9蛋白和sgRNA的结合，检测乳腺癌患者的ctDNA中PIK3CA E542K突变。GPHOXE是一种易于固定的纳米材料。由dCas9和sgRNA组成的生物识别复合物可以共价结合到GPHOXE上的氧化羰基基团上。在目标片段被生物识别复合物特异性识别后，电阻增加。电阻的变化可以通过电化学阻抗谱（EIS）分析来实现对ctDNA突变的检测。CRISPR-dCas9粉末阻抗测量系统具有短的检测时间（40秒），检测限为1.92 nM。它在10-220 nM的浓度范围内具有线性关系，并在临床样本中表现出高选择性和高重复性。

最近的一项研究中，CRISPR-Cas12a也被应用于BRAF V600E突变。提出了一种基于三维DNA行走子（3DDW）和CRISPR-Cas12a的顺式和反式切割特性的荧光检测策略，其中3DDW具有由发夹DNA行走子轨迹（DWs）组成的复杂轨迹。底物链（SSs）和磁珠（MBs）对于3DDW是必需的，而经生物素修饰的DWs和SSs被连接到MBs上。DWs和DWs与SSs之间都有互补的碱基序列。此外，DWs具有一个7个核苷酸的ctDNA识别序列，而SSs具有内切酶Nb.BbvCI的酶位点。目标序列与DWs中的互补缺口结合，作为目标ctDNA，DWs的3'识别序列暴露出来与SSs的互补序列连接。DWs形成了杂交结构，SSs可以被Nb.BbvCI切割释放DWs并输出DNA（ODs）。释放的DWs不断与SSs杂交，使得ODs也不断积累。经过磁分离去除MBs后，上清液加入CRISPR-Cas12a检测系统，包括Cas12a、一个被荧光基团修饰的报告探针和一个猝灭基团。ODs被Cas12a顺式切割，切割报告探针的反式，从而释放荧光信号。荧光分光光度计用于分析，最终实现了ctDNA的检测目的。该策略在1 fM至20 nM的浓度范围内显示出良好的线性关系；检测限为0.37 fM；技术具有高灵敏度和高特异性。在突变DNA和野生型DNA的混合比例中，该策略可以区分1:100,000的比例，并且在向健康志愿者的血清样本中添加不同浓度的突变DNA时，该方法也表现出良好的检测效果，显示出良好的临床应用潜力。

(2) 基于功能酶

除了限制性内切酶外，核糖核酸酶HII（RNase HII）和去氧核苷酸转移酶（TdT）在ctDNA突变检测中也起着重要作用。肿瘤精准用药基因基因检测开发了一种由三重螺旋分子开关（THMS）用于识别、RNase HII、信号转导探针（STP）、固定在电极上的捕获探针和TdT组成的生物传感器。当靶DNA存在时，THMS上的识别序列通过Watson-Crick的互补配对原理与靶DNA杂交，揭示了STP。此外，在RNase HII的作用下，杂交物被切断，释放出识别探针和靶DNA，用于下一个识别循环。STP可以被电极上的CP捕获，生成由MB装饰的类树状DNA，同时，在与脱氧胸腺嘧啶三磷酸、TdT、氧化还原活性珠和辅助探针的协作下获得电流信号。该方法对富含突变类型的突变体具有令人满意的检测效果（10 fM，1000:1）。在来自五例结肠直肠癌患者的血液样本中，该方法可以准确检测到单链KRAS G12DM突变。值得注意的是，该策略适用于通过改变识别探针来检测不同的ctDNA突变位点。

自2019年新型冠状病毒爆发以来，等温扩增（RPA、LAMP、RCA和RAA）已被广泛应用，并克服了PCR中复杂温度程序的问题，因为它只需要在恒定较低温度下进行快速扩增。CRISPR-Cas系统，例如SHERLOCK，DETECTR，SHINE和ADESSO，可以进行管式反应，快速高灵敏度地检测新型冠状病毒。这些方法能否应用于ctDNA突变检测？确实，肿瘤的临床基因检测还必须认识到，在ctDNA中检测肿瘤驱动的突变基因往往面临单碱基变化的情况；因此，必须对CRISPR-Cas系统中的sgRNA或crRNA进行优化。

(3) 基于纳米材料的检测

科学界还为ctDNA检测提供了不断变化的材料。肿瘤基因检测技术开发团队基于CRISPR-Cas9靶向耦合熵驱动链位移反应（ESDR）系统构建了一个3D石墨烯/Au-Pt-Pd纳米花生物传感器，用于检测患者ctDNA含量。该方法将基因编辑技术与纳米金属相结合。在ctDNA片段被CRISPR-Cas9靶向后，为熵驱动链位移反应提供了特异性引物，生成包含T1、R1和S1的三重亚单位探针。组装完整的3D石墨烯/Au-Pt-Pd纳米花来捕获T1序列并输出信号，实现ctDNA检测。此外，该方法成功应用于ctDNA中EGFR突变的检测，检测限为0.13 pM。虽然在血清背景下检测结果稍有降低，但回收值为91.75%-111.5%（RSD: 3.65%-9.26%）。该方法仍具有在复杂血液成分中检测极低频率ctDNA突变的潜力，并有望用于临床实际检测。为了检测DNA含量，许多研究人员探索了从分子DNA结构构建DNA纳米材料的方法。然而，其中大多数依赖于碱基互补配对原理中的氢键而不是更稳定的共价键，这易受Mg浓度或温度的影响，导致纳米材料组装失败。靶向药物基因检测构建了一种基于DNA纳米材料的特异性核酸微流控捕获装置。该装置由P-网状物、PVDF膜和PDMS微通道层的组合组装而成。P-网状物由与目标序列和纳米网状物对应的垫圈探针形成。通过改变目标探针，该方法实现了对六种不同目标序列的捕获。检测效率高达1 pm，能够有效检测单碱基变化序列。由于具有高特异性和高灵敏度的优势，这种敏感的核酸微流控捕获装置有望用于检测和富集ctDNA中的多个目标，进一步有助于患者的诊断和治疗策略制定。陈等人提出了一种ctDNA超灵敏检测方法，主要依赖于修饰的DNA探针在金包覆纳米材料和靶片段上的靶向识别。经过离心、洗涤和磁珠收集后，捕获到的杂交产物的电化学信号被捕获以进行检测。该方法能够检测20 nM至2 aM的DNA片段，最低检测限为3.3 aM。对于实际应用，不同片段大小的序列检测和101核苷酸ctDNA的检测也可达到200 pM。然而，该方法对于单点DNA突变的检测不敏感，需要进一步优化探针和系统。纳米孔是分析核酸生物标志物的单分子敏感装置。基于这个原理，设计了一种单核苷酸纳米孔检测方法，多重连接ctDNA。首先，设计了两个带有相应荧光标记的探针用于突变位点。当探针和突变基因完全退火和互补时，连接酶可以将两个探针连接起来发出荧光信号。使用链霉素包被的磁珠对捕获的片段进行纯化，但只有连接后的产物被分离，加热后产物从磁珠上释放。最后，利用电光纳米孔生物传感器分析产物，验证样本中是否存在目标突变。以乳腺癌中的ERBB2 S310F和PIK3CA H3140R突变为例，该方法在合成质粒模板和异种移植小鼠血液样本中得到验证，灵敏度达到96.6%。尽管该方法绕过了传统测序所需的PCR和文库制备步骤，从而节省了时间和成本，但操作过程更加复杂，需要专业人员进行操作，无法完全自动化。该方法的操作步骤还需要进一步简化，以在临床环境中用于ctDNA检测。

ctDNA的甲基化检测

对于甲基化的检测有许多方法。佳学基因综述了cfDNA甲基化分析的技术和生物信息学方法，包括基于甲基化限制性内切酶的甲基敏感切割计数法（MSCC）和HpaII-PCR介导的微小片段富集法（HELP），全基因组亚硫酸盐测序（WGBS），还原表征亚硫酸盐测序（RRBS），甲基化CpG串联扩增测序（MCTA-seq），靶向亚硫酸盐测序，基于亚硫酸盐转化的甲基化特异性PCR（MSP），甲基化DNA免疫沉淀测序（MeDIP-seq），基于甲基化CpG结合域蛋白的捕获测序（MBD-seq），5hmC-Seal，hmC-CATCH，羟甲基化DNA免疫沉淀测序（hMeDIP-seq），以及基于5-羟甲基化谱的氧化亚硫酸盐转化。

这些技术通常被应用于ctDNA的甲基化分析。WGBS被应用于检测小脑母细胞瘤患者脑脊液中ctDNA的甲基化状态。小脑母细胞瘤是一种在儿童中发病率较高且基因突变频率非常低但具有明显的表观遗传特征的脑肿瘤。结果显示，脑脊液中的大多数DNA是ctDNA。此外，ctDNA甲基化岛的甲基化水平在肿瘤组织样本和脑脊液中高度相关，相对保守，在个体之间高度一致，这表明甲基化状态可以作为高敏感性和可靠性的小脑母细胞瘤的生物标志物和分类依据。此外，使用训练集建立了多元Cox回归模型，验证了小脑母细胞瘤患者脑脊液中特征CpG位点的DNA甲基化状态可能被视为预测临床结果的潜在预后标志物。通过WGS和WGBS检测血液ctDNA中的基因突变和甲基化，可以特异性地针对去势抵抗性神经内分泌前列腺癌患者，这通常通过侵入性组织活检进行检测，并且由于其异质性难以获得完整的信息[86]。

随着材料科学、光学等学科的发展，越来越多具有优势的甲基化检测方法逐渐得到开发。佳学基因总结了过去5年中新开发的甲基化检测技术。

 Melt (DREAMing)用于稀有表观等位基因的鉴定

肿瘤复发监测基因检测开发的Melt（DREAMing）实现了对甲基化变异的单拷贝水平检测。具体步骤如下：首先，对从血液中提取的ctDNA进行亚硫酸盐处理。随后，将BST样品稀释至每个反应系统中的单个BST表观等位基因，称为准数码化。接下来，对稀释样品进行PCR扩增，并实时监测熔解曲线。最后，通过分析熔解曲线绘制"DREAM分析"直方图。

该方法结合了绝对稀释和熔解曲线两个概念，实现了对甲基化变异的检测，而无需进行甲基化测序。该方法简单、经济实惠，并且具有高灵敏度和特异性。然而，该方法仅能检测已知位点，扩增产物引起的非特异性杂交也是需要考虑的问题。DREAMing方法准确检测了NSCLC患者ctDNA中p14ARF和BRCA1的启动子甲基化。DREAMing比qMSP具有更高的灵敏度和特异性，并且通过焦磷酸测序确定的甲基化密度与DREAMing中的甲基化熔解温度呈正相关。
 

DISMIR

DISMIR是一种基于超低深度WGBS数据的方法。肿瘤基因检测将该方法归纳为四个步骤。首先，通过超低甲基化测序比较患有和未患有肿瘤的患者的血液甲基化谱，验证肿瘤特异性甲基化区域。其次，在肿瘤患者的血液样本中筛选出与特定甲基化位点相对应的reads。然后，通过整合DNA序列和甲基化信息构建深度学习模型，并计算d-score参数以评估从癌组织中读取的能力。最后，利用所有d-score来估计血浆样本的肿瘤源得分，并推断患者是否患有癌症。由于该方法只需进行超低深度的甲基化测序，所以检测成本相对较低。该方法的建立依赖于整个基因组中甲基化的分布，而不是单个位点的甲基化。因此，它被设计为一种以甲基化作为肿瘤生物标志物的模型。在早期阶段，训练集中筛选出大量肿瘤特异性甲基化区域，并确定相应的d-score。经由验证集对临床样本的验证后，它可以作为患有肿瘤的患者的临床诊断的另一种方法。以肝癌患者为例，DISMIR具有较高的敏感性和鲁棒性。

基于数字微流控（dmf）的检测

一种基于测序和DMF的方法被用于检测ctDNA中的甲基化位点。在测序之前，样本需要经过亚硫酸盐转化，以区分甲基化位点和非甲基化位点。设计带有生物素标记的PCR引物来扩增模板。PCR产物与链霉酸M280磁珠发生相互作用，然后在MF芯片上进行焦磷酸测序。特定的甲基化序列和测序引物之间发出的化学发光信号被用作甲基化结果的输出。与qPCR、测序和质谱法相比，该方法具有设备小巧、检测时间短、检测成本低（每次运行3.5美元）、检测线低和高灵敏度（达到95%）的优势。该方法能够在30分钟内准确检测到10 pg的甲基化模板。
 

基于双重识别的确定方法

基于肽核酸（PNA）和小分子连接DNA末端保护（TPSMLD），建立了一种基于双重识别的ctDNA确定方法。PNA是一种多功能探针，能够检测单个碱基对基因变异。TPSMLD可用于保护小分子DNA片段的末端基团，但在与靶蛋白结合时避免了ExoI消化。基于这些概念，基因解码基因检测开发了一种用于ctDNA的双重检测方法，该方法同时可以检测突变和甲基化。PNA与靶序列互补配对，实现了对突变的特异性检测，因为PNA与突变序列和正常序列之间的熔解温度差为11°C。此外，成功的甲基化检测取决于抗5-MC和甲基化位点的特异性识别。该方法成功应用于双链ctDNA和临床血清样本中PIK3CA E542K突变的检测，具有较高的特异性和灵敏性，并且检测限低至0.3161 pM。该方法适用于突变和甲基化同时发生的情况，但其缺点是灵敏性较低。