随着人们生活水平的提高,各类疾病的预防及治疗成为人们关注的重点。基因作为遗传因子,控制着生物的性状,是有遗传效应的DNA序列片段。随着人类基因组计划的完成和测序技术的不断发展,通过基因检测能够了解疾病类型,明确发病原因,同时进一步对这些基因信息进行解读、解码,对遗传疾病及肿瘤进行早期诊断及预防。
由于分子生物学的快速发展,基因测序技术也从领先代的Sanger测序发展到了第三代纳米孔测序,现三种测序技术共存,也说明了每个测序技术都有利弊。
领先代测序技术(Sanger测序)
Sanger测序(双脱氧末端终止法)的原理,将被荧光标记的ddNTP掺入到dNTP中,由于ddNTP随机掺入,PCR产物从引物之后的领先个碱基开始,每一个位置都有可能是ddNTP。由于ddNTP缺乏链延伸所需要的3’-OH,链的延伸就选择性地在G、A、T或C处终止。这样的PCR产物与普通PCR不一样,不能形成一条电泳带,而是一组长度相差一个碱基的成百上千种片段。它们具有共同的起始点,终止在不同的的核苷酸上,每一个碱基都有相同的概率被终止。将得到的不同大小的片段进行毛细管电泳,通过对荧光信号的采集和拼接,最终获得目的片段的序列。
领先代测序技术因其准确率高,读长长,多拷贝的优点,可以检测单基因病的突变类型,同时对未知突变的检测也很容易实行。但是领先代测序离不开PCR扩增,分析的DNA片段也只能是单个片段,导致通量很小,再加上自动化程度低,检测时间较长,所以并不适合对大量样本进行快速检测,而且成本高的缺点也限制了其不适用于大规模测序。
第二代测序技术(NGS高通量测序)
为了解决领先代测序的通量小的不足,第二代测序技术的出现解决了这一问题。
大多数的NGS测序
平台都是通过边合成边测序的方式,先将目标NDA 片段绑定在芯片上,然后再加入被标记的核苷酸,在NDA 聚合酶的作用下延长,捕获核苷酸信号,并进行整合,标出坐标,最后每个位点的DNA 序列通过计算机分析出来。二代测序技术能够将成千上万个测序反应在一个平台同时进行,提高了通量,且反应体系非常小,能在很短的时间内获得大量的碱基信息,极大地提高了测序速度,在保持高准确度的同时大幅度降低了测序成本。较高的自动化程度也使其在大规模测序工作中得到了广泛应用。
虽然第二代测序技术提高了通量,降低了成本,但在制备测序文库时仍需要经过PCR扩增,而这一过程可能引入突变或改变样品中核酸分子的比例关系;此外,第二代测序的读长普遍偏短,对引物的设计及技术要求较高,同时进行数据拼接时会遇到麻烦。
第三代测序技术(单分子测序)
第三代测序技术采用一种新的荧光类似物标记脱氧核苷酸,通过显微镜实时记录单个碱基的荧光强度变化,根据荧光的波长和峰值判断碱基类型,从而克服了前两代测序技术必须进行PCR扩增的缺陷,可直接读取序列信息,快速简便。
HeliScope测序技术在2008年的首次提出,是真正意义上的单分子测序技术,该技术最大的特点是无需扩增测序模板,而是使用一种高灵敏度的荧光探测仪直接对单链DNA模板进行合成法测序。首先将基因组DNA切割成随机的小片段DNA分子,并在每个片段末端加上poly-A尾;然后通过poly-A尾和固定在芯片上的poly-T杂交,将待测模板固定到芯片上,制成测序芯片;最后借助聚合酶将荧光标记的单核苷酸掺入到引物上,采集荧光信号,切除荧光标记基团,进行下一轮测序反应,如此反复,最终获得完整的序列信息。经过数百轮单碱基延伸可以获得25 bp或更长的测序长度。代表性的纳米孔测序技术在成本和速度方面都得到大幅提升,仪器也更加小型化。用于DNA 测序的纳米孔可大致分为两类: 生物纳米孔和固态纳米孔。
基因组测序能更多反映生物体的遗传信息,在临床医学及生命科学研究中有着十分重要的推动作用。基因检测技术主要应用于单基因遗传病的诊断、疾病相关基因的点突变检测、肿瘤的早期诊断。对于基因检测的进一步解读、临床数据的不断累积也是全新的重点。
随着测序技术的快速稳步发展,最新一代的测序技术还有许多不足之处,需要继续发展,克服技术难点,并通过基因检测来对疾病进行精准治疗,对人类的健康将产生巨大影响。