【肿瘤基因检测】肿瘤患者静脉血靶向药物基因检测准确性高吗？

靶向药物基因检测导读：

肿瘤靶向药物技术研究收集两组晚期非小细胞肺癌（NSCLC)患者的外周血样本,提取cfDNA进行Axen检测板靶向测序,并与组织活检结果进行比较,旨在评估ctDNA检测与组织活检的一致性。结果显示,对EGFR、KRAS等常见突变,两种检测高度一致;而对某些少见突变的检测,ctDNA与组织活检的一致性较低。该流程标准化了ctDNA提取、靶向测序和生物信息学分析,以保证检测结果的准确性。结果表明,ctDNA能准确检测多数常见驱动突变,但对部分少见突变检测仍需优化。该流程为ctDNA检测技术向临床转化提供了Protocol,有助于推动基于ctDNA的无创检测在非小细胞肺癌（NSCLC)精准医学中的应用。
 

患者入组

入组标准为肿瘤靶向药物基因检测合作医院医院确诊的20岁以上非小细胞肺癌患者。根据不同时间点的样本收集,将患者分为两个队列(A队列和B队列)。A队列包括新诊断的晚期或复发性非小细胞肺癌（NSCLC)患者,在进行一线系统化疗前取样作为baseline。B队列包括正在进行分子靶向治疗或免疫检查点抑制剂治疗的晚期或复发性非小细胞肺癌（NSCLC)患者,这些患者之前治疗取得肿瘤缩小但后来进展。排除标准为过去三年内有其他肿瘤病史的患者,或存在小细胞癌成分的患者。

本研究遵循赫尔辛基宣言(2013年修订版),经医院伦理委员会批准,所有患者签署知情同意书。

血样收集及cfDNA提取

所有入组患者在每次临床随诊时进行常规血液采样,同时在知情同意下额外采集研究用血样。A队列患者在开始治疗时、第二周期化疗前和确诊疾病进展时各采集三份血样。B队列患者在入组后按照治疗反应评估时间表定期采血,疾病进展时采集最后一份血样。考虑到时间和费用限制,本研究仅分析了A队列baseline时的样本及B队列疾病进展时的样本。

每位患者采集约10ml全血,使用Roche细胞游离DNA收集管,4°C下1000g离心10分钟。收集上清5ml用于提取cfDNA,使用QIAamp Circulating Nucleic Acid试剂盒提取cfDNA,-70°C至-80°C保存。用Qubit dsDNA HS试剂盒和2100生物分析仪检测提取cfDNA的浓度和总量。

肿瘤组织基因分型和靶向测序

初诊时所有患者的FFPE肿瘤组织样本进行驱动基因检测以指导临床用药。EGFR外显子19缺失和外显子21 L858R突变通过PANA Mutyper试剂盒检测。ALK融合通过VENTANA ALK (D5F3) IHC和(或)FISH断裂信号检测。PD-L1表达通过免疫组化检测,使用抗体包括22C3 pharmDx、Ventana SP263。

靶向测序的肿瘤组织DNA从FFPE切片中提取,使用QIAamp DNA FFPE Tissue试剂盒提取,电泳和Qubit法对提取DNA进行质量控制。

靶向测序和变异检出分析

ctDNA和肿瘤组织DNA均使用Axen Cancer Panel 2进行靶向测序,覆盖171个基因和25个融合基因重排,测序深度约为4000X。reads比对参考基因组hg19,使用GATK4.1.2和MuTect2从align过的reads中检出体细胞变异。使用ANNOVAR数据库对变异进行注释,筛选标准包括:gnomAD和NARD数据库报告频率小于1%的外显子变异、预测为有害的变异、在ClinVar数据库中无良性记录的变异等。进一步滤除not达到MuTect2似然比阈值及base quality要求的变异。对组织样本设置测序depth>200,VAF>5%的过滤条件;对ctDNA样本,由于低丰度的变异,设depth>50,变异reads数>10为阈值。统计变异总数计算TMB。使用COSMIC数据库识别与肺癌相关的变异。

统计学分析

使用R 4.1版本进行统计分析。采用秩和检验和卡方检验分析临床特征差异。使用皮尔逊相关系数评估变量相关性。OS定义为A队列从入组起至死亡时间,B队列从疾病进展起至死亡时间。应用Kaplan-Meier法绘制生存曲线,Log-rank检验进行组间比较。计算ctDNA相对组织检测的敏感性和精确度。