在没有添加添加和标准曲线的情况下，所有技术都依赖于相对而非先进量化，这意味着 miRNA 的差异表现为配对样本之间的“倍数变化”，而不是先进单位，需要有关丰度背景的信息.实验工作必须显示 miRNA 变化的下游效应作为 miRNA 功能的读数，特别是通过比较多个 miRNA 的谱与靶蛋白的差异表达。理想情况下，对 RISC 中的 miRNA/mRNA 双链体进行分析以证明直接相互作用。

 

miRNA 的治疗性操作

miRNA 的核心作用是通过结合和沉默特定靶 mRNA 来抑制蛋白质表达，从而减少蛋白质合成。因此，miRNA 为操纵蛋白质合成提供了一种诱人的机制。在大多数情况下，miRNA 的过表达会抑制其直接靶标，而抑制内源性 miRNA 会去抑制它们的表达。

 

未修饰的 RNA 链在给药后被降解；因此，miRNA 治疗需要有效的细胞类型特异性递送方法或增强稳定性但保留 miRNA 功能的修饰。目前，miRNA 疗法的临床研究主要使用 miRNAs 抑制剂（抗 miRs）。抗 miR 是合成的单链 RNA，由与内源性 miRNA 互补的核苷酸组成。已经设计了各种结构修饰以增加它们在循环中的半衰期、绕过组织中的降解并增强细胞内递送 (10)。心肌腺相关病毒实现有效的心肌细胞特异性 miRNA 递送 (11)。腺相关病毒介导的寡核苷酸递送的转化潜力已在其他地方进行了综述 (12)。目前，过表达 miRNA 通常被认为不如抑制内源性 miRNA 安全。

 

Miravirsen 是一种针对 miR-122 的抗 miR，用于治疗丙型肝炎 (13)，已完成多中心 2a 期试验 (14)，目前正在进行 2b 期试验。选择 miR-122 作为先进个治疗靶点突出了靶向心血管疾病 (CVD) 时的挑战。首先，miR-122 显示出极好的组织特异性，而大多数被确定为 CVD 治疗靶点的 miRNA 普遍表达，引发了对脱靶效应的担忧。其次，抗 miR 主要在肝脏和肾脏中积累，从而避免了对组织特异性靶向的需求 (13)。后者通过评估抗 miR-21 作为 Alport 肾病的治疗方法得到进一步说明 (15)。这些正在进行的临床试验将为 miRNA 疗法的实际应用提供更多见解。

 

用全身性抗 miR 靶向心脏或脉管系统需要显着更高的剂量，而且效率可能很低。尽管 Miravirsen 的临床试验没有发现人类肾损伤的证据，但动物模型已显示某些抗 miR 剂量较高时的肾毒性 (14)。人类免疫系统已经进化到可以检测病毒 RNA。 Toll 样受体识别单链和双链 RNA (16)。高剂量的合成寡核苷酸可能会引发免疫反应，从而影响疗效和安全性。因此，心血管应用将需要针对局部或细胞类型特异性递送的解决方案，以及临床可检测、高效的读数，以监测成功的目标参与。

 

在细胞水平上，心力衰竭是由心肌细胞功能障碍和细胞外基质 (ECM) 积累引起的纤维化引起的。这些过程几乎有效没有通过标准的心力衰竭治疗方案进行治疗。

 

miR-133 在心肌细胞中非常丰富，但在肥大动物模型和肥厚型心肌病患者中减少 (17)。体外和体内研究表明，抑制 miR-133 后肥大增加，过表达 miR-133 后心脏功能得以保留。 β-1 肾上腺素能受体通路的靶向是心力衰竭进展和治疗的核心，被认为是潜在的机制 (18)。除了心脏，miR-133 也存在于骨骼肌中，尽管其水平低于心肌细胞。在这里，miR-133 抑制再次增加对肾上腺素能刺激的反应并促进向棕色脂肪组织的分化 (19)。 miR-133 操作似乎也影响心脏动作电位 (20)。

 

MiR-1 与 miR-133 属于同一簇，具有相同的丰度，以及在心力衰竭患者中的​​较低表达 (21)。 miR-1 表达的增加 (22) 和减少 (23) 都会导致电生理异常。有趣的是，miR-1 靶向胰岛素样生长因子-1，其本身抑制 pre-miR-1 转录物的加工 (21)。胰岛素样生长因子-1 通路是导致心脏肥大和心律失常的重要因素，增加 miR-1 水平似乎可以改善心脏功能 (24)。

 

MiR-208 在心肌细胞中也高度富集，并调节 α- 和 β-肌球蛋白重链 (MHC) 之间的平衡。 β-MHC 同种型的诱导是一种已知的对心脏压力的不适应反应并降低收缩力 (25)。 MiR-208 敲除小鼠和用抗 miR-208 全身治疗的大鼠，在两种 MHC 同种型之间保持平衡，以应对实验性心脏压力，并具有更好的心脏功能 (26)。因此，已建议将 MiR-208 抑制作为心力衰竭的保护性治疗。然而，β-MHC 表达在 miR-208 敲除小鼠的正常心脏中没有改变，这表明这种 miRNA 的作用取决于疾病背景或受平行对照的影响 (27)。此外，贼近来自人类心脏的深度测序数据表明，与其他心脏 miRNA（如 miR-1 和 miR-133）相比，miR-208 的表达相对较低（28）。 2011 年宣布了使用 miR-208 抑制心力衰竭的临床前试验，但尚未取得进一步进展。

 

在一项研究中，miR-25 表达在衰竭的人类心脏中受到抑制 (29)，但在另一项研究中其表达增加 (30)。前一项研究描述了有害的胚胎基因程序使心脏功能恶化的靶向，后者显示抑制肌质/内质网钙腺苷三磷酸酶 (SERCA)，这是心肌细胞兴奋 - 收缩耦合的重要贡献者，以及随后的心脏改善功能。抗 miR 治疗的时间和化学性质以及研究持续时间的差异可以解释这些矛盾的结果。这突出了确定贼佳抗 miR 化学的艰巨任务，因为即使在小寡核苷酸中也可以引入修饰的组合可能性。针对相同 miRNA 的不同寡核苷酸可能无法获得相同的治疗益处。

 

已提出 miRNA 作为心脏再生细胞疗法的替代方案。对新生大鼠心肌细胞增殖的研究强调了 miR-199a 和 miR-590 能够诱导有丝分裂 (31)。在心肌梗塞 (MI) 后将这些 miRNA 注入啮齿动物心脏可保留心脏功能。同样，抑制 miR-34a 可改善小鼠心肌梗死后的心脏功能，减少心肌细胞凋亡和端粒缩短 (32)。基于 miRNA 的心脏再生和修复疗法仍需要在具有更大转化潜力的模型中进行验证。目前在 CVD 中用于治疗应用的 miRNA 是 miR-92a。抑制 miR-92a 可减少内皮炎症 (33) 并促进缺血性心肌的血管生成和功能恢复 (34)。然而，这种 miRNA 是 miRNA 基因簇 (miR-17∼92) 的一部分，也称为 oncomiR-1，因为它的成员靶向细胞周期调节。这引发了对 miR-92a 治疗剂潜在副作用的担忧。

 

几种 miRNA 与心脏成纤维细胞存活和相关信号通路有关。虽然一些 miRNA 直接靶向编码 ECM 蛋白 35、36 的基因，但其他 miRNA 阻止心脏成纤维细胞获得活化的分泌表型 37、38。除了在心脏肥大中的作用外，miR-133 被认为通过靶向结缔组织生长因子来抗纤维化，纤维化过程的关键调节剂 (37)，以及胶原蛋白 I α-1，心脏 ECM (39) 的主要成分。

 

MiR-21 已在纤维化背景下进行了贼广泛的研究。这种 miRNA 在心力衰竭患者和纤维化小鼠心脏的心脏成纤维细胞中增加 (40)，并在后负荷增加 (41) 和心肌缺血 (42) 的小鼠模型中促进 ECM 沉积。在心力衰竭小鼠模型中，体内抑制 miR-21 可减弱纤维化反应并改善心脏功能 (41)。在随后使用不同抗 miR 的研究中没有重现这些结果，重申了优化抗 miR 化学的重要性 (43)。 MiR-21 也是 miRNA 的一个例子，其中引导链和过客链都介导功能，过客链从成纤维细胞转移到心肌细胞，在那里发挥促肥大作用 (6)。这凸显了将临床前模型的发现转化为患者的另一个困难。如果两条链都介导功能，那么通过抗 miR 治疗仅抑制 1 条链可能无法概括在敲除小鼠中观察到的表型，其中两条链都从基因组中删除。

 

除了促纤维化作用外，miR-21 通过对血管平滑肌细胞 (SMC) 的促增殖和抗凋亡作用增强新内膜生长 (44)。抑制 miR-21 可减少动物的支架内再狭窄 (45)。 miRNA 洗脱支架的开发 (46) 可以克服 miRNA 治疗的主要挑战之一，因为局部递送降低了脱靶效应的风险。 miR-29b 也是如此，它抑制血管 SMC 产生 ECM (47)，而抑制会减缓腹主动脉瘤进展 (48) 并促进动脉粥样硬化小鼠的有利斑块重塑 (49)。如果开发了洗脱抗 miR-29b 的支架以抑制动脉瘤进展或稳定有症状的动脉粥样硬化斑块，则在局部递送 miR-29b 拮抗剂可以更巧妙地改变 ECM 平衡。

 

动脉粥样硬化的关键事件是内皮损伤和 SMC 从收缩表型转变为合成表型。 MiR-143 和 miR-145 作为一个簇一起转录，在 SMC 中含量非常丰富，在新内膜形成的血管中观察到显着的下调 50, 51。这些 miRNA 一起调节血管 SMC 分化，因此，它们的损失有助于 SMC 去分化和动脉粥样硬化 (52)。 MiR-126 在内皮细胞中高度富集 (53)。它间接增强血管内皮生长因子信号传导，因此已在血管生成和内皮修复的背景下进行了研究。有趣的是，这种 miRNA 的内皮效应似乎是由过客链而不是引导链介导的 (54)。尽管 miR-126 已被描述为内皮细胞特异性 (53)，但该 miRNA 在巨核细胞中表达，并可能在本文其他地方提到的血小板功能中发挥作用。

 

MiR-122 在肝脏中非常丰富 55, 56。降低 miR-122 水平的药理学策略降低了血浆胆固醇水平 13, 55。不幸的是，贼初的乐观情绪被随后的研究所抑制，这些研究显示高密度脂蛋白胆固醇水平同时下降(57)。 miR-33（一种调节胆固醇代谢的 miRNA）也获得了类似的发现。短期抑制是有益的 58, 59，但长期抑制高脂饮食的动物会产生有害影响，例如肝脏脂肪变性 (60)。贼近，一项针对人类肝细胞的研究将 miR-148a 确定为低密度脂蛋白胆固醇受体的调节剂 (61)。 miR-148a的全身抑制导致血浆低密度脂蛋白胆固醇显着降低，但也增加了高密度脂蛋白胆固醇水平。抑制 miR-122 和 miR-33 的长期副作用，再加上针对血脂异常的新治疗方案的出现，可能会限制 miRNAs 调节脂质代谢的临床应用。

 

miRNA 在血浆或血清中都存在、稳定且可检测到循环 (62)，它们要么与蛋白质复合物结合，要么包含在微泡或脂蛋白中。微泡和脂蛋白携带的 miRNA 被认为在递送到细胞 63、64、65、66 时会影响蛋白质表达。例如，miR-223 在血浆中相对丰富，并且可能在血细胞和血管细胞之间转导内分泌信号(67)。由于循环 miRNA 的先进水平较低，仍有待证明 miRNA 转移是否足以在受体细胞中实现有效的靶点抑制。

 

MI 后早期血液中可检测到几种心脏 miRNA，可能会缩短诊断时间 (68)。然而，与已建立的生物标志物（如高灵敏度肌钙蛋白）的头对头比较发现，miRNA 的检测并没有提高当前方法的正确性或实用性 (69)。此外，当前的 miRNA 检测技术耗时且不能快速诊断 MI 患者。在肥厚型心肌病的背景下，较高水平的 miR-29a 与肥大和纤维化相关 (70)，但除了目前的诊断工具之外，它的临床益处仍不清楚。

 

新的生物标志物搜索应侧重于未满足的临床需求，而不是已经存在表现良好、已建立标志物的领域。例如，当前的 MI 风险预测模型可以改进。三项研究虽然采用不同的方法，但在继续遭受急性 MI 71、72、73 的患者中检测到差异表达的 miRNA。Karakas 等人。 (71) 发现单个 miRNA 与心血管死亡风险之间存在惊人的强相关性，尽管这是在高度选择的人群中进行的，并且没有与传统的风险模型进行比较。在 Bye 等人的研究中，没有单一的 miRNA 赋予急性心肌梗死风险的临床显着变化。 (72) 或由 Zampetaki 等人撰写。 (73)，但 miRNA 面板的综合用途提高了传统弗雷明汉风险模型的预测能力。 Zampetaki 等人选择的 miRNA。 (73) 还预测了一组有症状的冠状动脉疾病患者的死亡率 (74)。已经报道了其中 2 种 miRNA 与血小板功能之间的机制联系：miR-126 (75) 和 miR-223 (76)。循环 miRNA 可以来自多种细胞类型，但血小板的贡献很大 75, 76。循环 miRNA 的水平受抗血小板治疗的影响 (77)，并与心肌梗死后患者现有的血小板反应性测定相关 (75 ）。血小板 miRNA 与高反应性血小板有关 (78)。

 

结论

miRNA 可以调节蛋白质表达，因此是理解和治疗 CVD 的热门话题。目前的治疗策略侧重于全身性抗 miR 递送，这引起了对脱靶效应的担忧，包括血小板活化 (79)。未来的努力应该旨在评估特定细胞类型的策略或本地交付。对于心血管系统，可以通过使用腺相关病毒载体进行细胞类型特异性 miRNA 递送或纳米颗粒结合的抗 miR 或 miRNA 模拟物来实现增强的靶向性 (80)。

 

临床前研究主要集中在确定单一组织或细胞类型内的机制。然而，需要谨慎以避免过快地进行临床评估。 miRNA 对蛋白质表达的调节高度依赖于环境和细胞类型，它们的普遍表达使得 miRNA 疗法的副作用无法预测。因此，针对单个 miRNAs 需要对全身效应进行细致的评估。推进 miRNA 疗法的谨慎方法可能会减缓临床应用的进展，但可能会使 miRNA 疗法免于与基因疗法类似的挫折。 miRNA 的巨大潜力证明了在 CVD 的大规模临床研究之前进行忧虑是合理的。

 

循环 miRNA 在疾病表型中的表达存在差异，并被认为是新的生物标志物。它们的血小板来源可以使循环 miRNA 在 CVD 的背景下特别相关。血小板反应性可能会带来心血管风险，但没有单一公认的生物标志物。需要在更大的队列中进行更多的机制研究和验证，以确定 miRNA 生物标志物的临床效用。