【佳学基因检测】基因检测中如何进行非编码RNA和全转录组联合分析
根据基因解码体系，人体基因组即包括全外显子测序中的主要组成部分编码区，也包括非蛋白质编码部分。人类基因组不到2%属于编码区，超过98%的区域为非编码区。基因解码表明，人类基因组非编码区至少80%是有生物活性的，并非基于数据库比较的基因检测所认为的非编码区是人体内的"垃圾"DNA，没有检测的和分析的意义。从狭义上来说，转录组是指转录出来的所有mRNA的集合；从广义上来说，转录组是指细胞内所有转录产物的集合（包括mRNA和非编码RNA)。
miRNA, circRNA以及lncRNA作为一类具有调控功能的非编码RNA，是基因解码体系中的重要内容，并且调控对象均与mRNA有关。佳学基因解码为了更好地普及除全外显子基因检测以外的基因信息知识，特以此为概述非编码RNA分子信息在人体疾病发生、发展及正常生理过程中的作用，同时介绍基因解码知识体系中的ceRNA理论以及相关的全转录组联合分析建库和分析策略。
非编码RNA概述
1.1 miRNA
miRNA是存在于人体内一类具有调控功能的内源性非编码RNA, 其大小约18~25个核苷酸。基因解码信息资源miRBase数据库（www.mirbase.org）收集了已经进行过同行评议研究的miRNA序列及生物学功能解释 ，是采用数据库比对技术可以借鉴的miRNA常用的数据库。
成熟的 miRNAs 是由较长的初级转录物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生的（首先miRNA基因通过RNA聚合酶II转录生成初级miRNA (pri-miRNA)，pri-miRNA 在核酸酶 Drosha 的作用下，形成了 miRNA 的前体（pre-miRNA），pre-miRNA 在转运蛋白作用下转运至细胞质，Dicer酶将pre-miRNA的茎-环结构剪切成为长约22个核苷酸的双链RNA片段，贼后其中一条链被降解，另一条链形成成熟的miRNA），随后组装进 RNA 诱导的沉默复合体（RISC)，通过碱基互补配对的方式识别靶标mRNA，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶标mRNA 或者抑制靶标mRNA 的翻译，从而参与人体的正常生理过程。miRNA及其调节靶序列的基因突变，即使不影响蛋白质的结构，也会通过影响蛋白质的表达时空及组织特异性，而参与疾病的发生，对这一过程的理解和掌握是目前基因解码技术所特有的。是基因信息分析超出普通过数据库比对的地方。在人体，一般成熟miRNA的种子序列（5'端到3'端的2-8位核苷酸）与mRNA的3' UTR不有效互补配对，从而抑制mRNA的翻译。
miRNA作用机理
1.2 circRNA
circRNA是一类具有闭合环状结构的非编码RNA分子, 没有5'帽子结构和3' poly(A)尾巴结构，广泛存在于人体的各种组织、生理及病理过程的多个阶段。circRNA不容易被核酸外切酶（RNase R)降解，比线性RNA更稳定，使得circRNA在开发疾病新型诊断与治疗方法上具有巨大潜力。基因解码数据库中circBase数据库(http://www.circbase.org)收集了人、小鼠等多个物种的circRNA信息。
根据circRNA来源的基因组区域，可以将circRNA分为外显子circRNA（ecircRNA), 内含子circRNA(ciRNA), 外显子-内含子circRNA(EIciRNA)和基因间区circRNA，其中外显子circRNA是人体内贼普遍的一类circRNA。外显子circRNA来源于pre-mRNA 发生的反向剪切，在反向剪切的过程中，5’剪切位点下游与 3’剪切位点上游连接在一起形成 3’，5’磷酸二酯键。
基因解码清晰地揭示出，circRNA可以充当miRNA和蛋白质的分子海绵、影响转录、干扰mRNA前体的正常剪接、调控mRNA分子翻译、形成环形RNA蛋白质复合体、与mRNA竞争性结合蛋白质等机制，参与免疫、代谢、神经系统发育和细胞增殖等生物学过程中。
cirRNA的功能和生物医学应用
1.3 lncRNA
lncRNA是指一类长度大于200nt的长链非编码RNA。根据与编码基因的相对位置，可将lncRNA分为基因间型(intergenic lncRNAs)、内含子型(intronic lncRNAs)、反义型(antisense lncRNAs)、正义重叠型(Sense-overlapping lncRNAs)类型。
大多数lncRNA由RNA聚合酶II (Pol II) 转录产生，具有5'帽子结构和3' poly(A)尾巴结构，但是其加工剪接效率较低，并且呈现出明显的细胞核定位现象。定位在细胞核的lncRNA，可以与DNA、RNA、蛋白质等多种分子相互作用，调控染色体结构和功能；通过顺式（cis)或反式(trans)调控基因的转录，影响mRNA的剪接、稳定和翻译等。剪接加工有效的lncRNA转运至细胞质，在转录后水平反式调控基因表达（如调节mRNA翻译和降解等）。
lncRNA转录水平调控
02 ceRNA假说
哈佛医学院Pier Paolo Pandolfi研究小组于2011年提出了竞争性内源RNA(ceRNA)假说，假说认为内源性RNA分子（如circRNA，lncRNA，假基因等)具有miRNA作用位点，可以竞争性地与miRNA结合，从而间接调控miRNA靶基因的表达。
当ceRNA表达沉默时，mRNA在miRNA介导的沉默复合体(RISC)作用下被降解或翻译被抑制；而当ceRNA表达激活后，可竞争性结合miRNA的RISC复合物，降低miRNA降解mRNA或抑制翻译的功能，从而上调基因的表达量。
ceRNA机制（a.假基因沉默，b.假基因激活）
03 全转录组联合分析
在生物体内，任何一类RNA分子都不是孤立的，它们行使不同的生物学功能，共同参与生物体复杂的调控机制。全转录组关联分析的原理是基于非编码RNA分子可以参与调控mRNA的表达以及ceRNA 假说。全转录组联合分析是指针对一份样品同时分析mRNA, lncRNA, circRNA和miRNA之间的联合调控关系，构建全面精细的RNA调控网络，更好地阐明生物学相关的问题。
3.1 建库策略
建两个库：分别建Total RNA（包含mRNA, circRNA, lncRNA)的文库和建miRNA的文库，缺点是环状RNA有效数据量低，不易检测到低丰度的环状RNA。
建三个库：分别建Total RNA（包含mRNA, circRNA, lncRNA)的文库，miRNA的文库和富集circRNA的文库。富集circRNA的文库利用环状RNA可以抵御核酸外切酶降解的特点，往样本中加入核酸外切酶，去除线性RNA而仅保留环状RNA，从而排除了线性RNA的干扰，提高了环状RNA的有效数据量。
3.2 联合分析策略
全转录组联合分析策略分为WTS和共表达分析。
WTS分析是基于差异比较组合之间差异表达的RNA分子序列信息，预测差异表达RNA分子两两间的靶向关系（考虑序列的互补配对和结合自由能等），构建非编码RNA分子和mRNA的调控网络。
共表达分析是基于多个样本（大于5个）的不同分子的表达量进行表达相关性分析，筛选显著相关的靶向关系（其中miRNA与靶标基因呈负相关) 构建非编码RNA分子与mRNA的共表达网络。客户可根据自身需要以及实验的样本情况，选择合适的分析方法或整合两种方法。
